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qPCR实验常见问题及解决方法

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qPCR实验常见问题及解决方法  PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。可以在短时间内将微量的DNA片段扩增到足够数量，用于后续的研究和检测。下面让我们一起来看看qPCR实验的常见问题及解决方法吧！

一、扩增曲线不稳定

可能原因

RNA纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。

解决方案

1）提取高纯度的RNA，小心操作。

2）对仪器进行校准。

二、扩增无法达到平台期

可能原因

模板浓度太低；循环数太少；试剂扩增效率低。

解决方案

1) 提高模板量

2) 提高循环数

3) 用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。

三、荧光下降

可能原因

存在降解；模板浓度过高。

解决方案

1) 提高体系纯度

2) 降低模板量

3) 降低荧光阈值

四、单峰、峰不尖锐

可能原因

与试剂成分有关；或存在大小相近的非特异性扩增。

解决方案

1) 温度跨度不高于7度，视为可用结果

2) 进行高浓度琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。

五、单峰，Tm低于80度

可能原因

只有引物二聚体，无目的条带；或扩增片段过短。

解决方案

1) 检查是否加入模板

2) 进行琼脂糖电泳检测，确定条带大小是否正确

六、双峰，较低峰Tm在80度之前

可能原因

由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。

解决方案

1) 适当提高退火温度

2) 提高模板量，降低引物浓度

3) 重新设计引物。

七、qPCR注意事项

·提高样品纯度，尽量减少样品之间的交叉污染。

·每个样品至少要做3个平行孔，以防在 后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

·MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好融解后放 在4℃；配置体系时在冰上操作；减少加样误差，每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样；所有成分加完后，离心去除气泡。

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菌种保藏的常见方法

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菌种保藏的常见方法

　　菌种保藏的常见方法
　　菌种保藏是指保持微生物菌株的活力和遗传性状的技术。微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退。菌种保藏的目的就是使菌株存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，保持菌种原有的活性和各种特征。菌种保藏的基本原理是使微生物的生命活动处于半永j性的休眠状态，也就是将微生物的新陈代谢作用限制在z低范围内。那么你知道菌种保藏的常见方法有什么吗？让我们一起来看看吧！
　　实验室常用的保菌方法有：甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液体石蜡覆盖保藏法、沙土保藏法、冷冻干燥法。微基生物在以上几种菌种保藏方法的基础上，开发出了保菌效果更好瓷珠保菌法。
　　一、甘油保菌法
　　此方法适用于菌种的中长期保藏，保藏时间可在1年以上。由于甘油本身十分粘稠，很难定量，因此一般将甘油和生理盐水按1:1的比例配成终浓度为50%的甘油溶液。使用时，按50%甘油：菌液=1:1的比例混合，使甘油终浓度在20-30%即可，甘油浓度过高或过低都不利于菌种保藏。将甘油菌种转移至-80℃冰箱长期冻存。需要取用菌种的时候，将冻存管放在37℃水浴中快速解冻，直到菌种完q融化，此时可取出菌种进行实验。
　　二、斜面保菌法
　　将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后转移至4℃冰箱中保藏。保藏的时间根据微生物的种类而不同，一般霉菌、放线菌及产芽孢的细菌保存2-4个月就需要移种一次，酵母菌为两个月，而细菌最好一个月移种一次。需要取用菌种的时候，可用接种环在斜面上挑取少量菌体进行接种。
　　三、穿刺保菌法
　　准备一管半固体培养基，用接种针挑取菌种，自半固体培养基的中心垂直刺入，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线将接种针退出，于4℃冰箱保存。此方法同斜面保菌法一样需要定期移种。
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细胞转染的方法

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细胞转染的方法

　　转染（Transfection），是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
　　转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。那么你知道细胞转染的方法有什么吗？让我们一起来看看吧！
　　转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
　　一、化学转染法：
　　1.磷酸钙法
　　原理：磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞
　　应用：稳转，瞬转
　　特点：不适用于原代细胞，操作简便但重复性差，有些细胞不适用
　　2.阳离子脂质法
　　原理：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞
　　应用：稳转，瞬转，所有细胞
　　特点：适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清，转染效果随细胞类型变化大
　　3.DEAE-右旋糖苷法
　　原理：带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞
　　应用：瞬转
　　特点：相对简便、结果可重复，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清
　　二、生物转染法
　　1.病毒介导法
　　原理：通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中
　　应用：稳转
　　特点：可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等
　　2.逆转录病毒
　　应用：持定宿主
　　特点：但携带基因不能太大细胞需处分裂，需考虑安全因素
　　3.腺病毒
　　原理：通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中
　　应用：瞬时转染，待定宿主
　　特点：可用于难转染的细胞，需考虑安全因素
　　三、物理转染法
　　1.Biolistic颗粒传递法
　　原理：将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在细胞内逐步释放表达
　　应用：瞬转
　　特点：可用于:人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞
　　2.电穿孔法
　　原理：高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入
　　应用：稳转，瞬转，所有细胞
　　特点：适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大
　　3.显微注射法
　　原理：用显微操作将DNA直接注入靶细胞核
　　应用：稳转，瞬转
　　特点：染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
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细胞消化的方法有什么

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细胞消化的方法有什么

　　细胞消化的方法有什么
　　在贴壁细胞传代前必需将细胞与贴附介质分离，常见的方式就是通过胰蛋白酶对细胞进行消化。那么你知道细胞消化的方法有哪些吗？让我们一起来看看吧!
　　一、机械消化法
　　直接用液体吹打或用刮刀，施予外力让细胞与培养底物分离；适用于贴壁性弱的细胞传代，但相较于其它消化方法，这种外力无法量化控制，细胞分散效果差，且可能会造成大量细胞破损，使内容物释放到培养基，进而影响细胞传代状态。
　　二、离子螯合法
　　细胞膜表面蛋白大多需要钙、镁离子来维持与胞外基质的稳定键结，当然也包含各种黏附蛋白（例：整合素、钙黏着蛋白、桥粒等），螯合剂会在不破坏细胞膜表面蛋白的状况下，抽离这些离子，使黏附蛋白失活而减少细胞-细胞间及细胞-底物间的连接作用，让细胞较容易在施予外力时，脱离培养底物并促进细胞分散。
　　0.02%EDTA是细胞传代常用的离子螯合剂，在37℃作用效果佳（消化较敏感的细胞可在4℃作用），适用于消化一般贴壁性细胞或细胞表面标记实验细胞。但EDTA无法用血清终止其反应，所以在消化细胞后必须用缓冲盐溶液（如：PBS）清洗离心，以免影响后续细胞贴盘效果。
　　三、酶消化法
　　用蛋白水解酶消化连接细胞及培养底物的蛋白质，适用于消化贴壁性稍强的细胞。
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ALZET 渗透压泵 MODEL2002的使用方法与注意事项

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ALZET 渗透压泵 MODEL2002的使用方法与注意事项

ALZET 渗透压泵是一种小型、可植入式的胶囊，可应用于小鼠、大鼠及其他实验动物研究。该渗透压泵无需进行外部连接或频繁处理，就能以恒定的速率持续给药一天到六周的时间。那么你知道ALZET 渗透压泵 MODEL2002的使用方法与注意事项吗？让我们一起来看看吧！

一、ALZET 渗透压泵灌注方法

1. 称重空渗透压泵以及它的流量调节器（总重）

2. 利用 27 式灌装管以及 1mL 的注射器灌装渗透压泵。若使用较大注射器，由于灌装速度过快， 可能会在胶囊中产生气泡。用注射器抽取药物溶液，装上灌装管。需要注意的是注射器和与其连 接的灌装管之间不能有气泡。

3. 拔掉流量调节器，将渗透压泵直立，从渗透压泵顶部的小开口插入灌流管，直到不能再插入为 止。此时灌流管的jian端接近胶囊的底部。

4. 保持渗透压泵直立，缓慢推注射器的活塞。当药物溶液到达胶囊顶部小开口处停止灌注，小心 移去灌注管（速度快了可能会产生气泡） 。

5. 檫掉溢出的药物溶液，插入流量调节器直到白色帽子到达渗透压泵顶部为止。插入的流量调节 器将会取代部分已经灌注到渗透压泵中的药物溶液，溢出的溶液需要擦干净。确保该装置正常运  行，需要将流量调节器全部插进渗透压泵中。

6. 称量灌满后的渗透压泵（连同流量调节器） ，步骤 6 和步骤 1 的差值为灌注的药物溶液的净重。 对于大多数稀释的水溶液，重量（mg）=体积(µl）。灌注的体积应该大于平均灌注体积（Mean Fill Volume）的 90%，即 244.6*0.9=220.41。如果是这样的话，灌装后的渗透压泵就可以使用了，如果不满足以上条件，说明渗透压泵中含有气泡，不能使用。

二、注意事项

1.ALZET 渗透压泵不可重复使用

2.渗透压泵必须被溶液充满灌注量

3.溶解药物的溶剂需与渗透压泵材料相兼容

4.在实验过程中药物在溶剂中要保持稳定

5.在对渗透压泵进行灌注，操作以及手术植入过程中要确保无菌

6.如果要想渗透压泵立刻起作用，或者渗透压泵中灌注的是粘性溶液，或者如果附加一根导管，那么渗透压泵在无菌的 37°C生理盐水中至少孵育4-6小时(最好是过夜) 。

7.如果渗透压泵使用的环境与正常的哺乳动物的体温以及渗透压显著不同时 ，渗透压泵的泵送率可能会受到影响。

更多有关ALZET 渗透压泵 MODEL2002的使用方法与注意事项，请联系ALZET 渗透压泵代理——上海金畔生物科技有限公司。

polysciences 23966-1的使用方法

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polysciences 23966-1的使用方法

PEI25K是一种功能强大、值得信赖且具有成本效益的瞬时转染试剂。在HEK293和CHO表达系统中，PEI提供始终如一的高基因表达（96孔板至100L生物反应器）。由于Polysciences PEI在科研工作中凸显关键优势，致使转向此试剂的使用者与公司逐年增多。相对于其他选择，使用PEI在内部制备转染试剂可以使总转染成本降低40%。在学习polysciences 23966-1使用方法之前我们先了解一下产品属性吧！
一、产品属性
CAS Number：9002-98-6, 26913-06-4
分子式：(CH2CH2NH)n
外观：白色至黄色固体
熔点：73-75º
分子量：25000
溶解性：热水、低pH冷水、甲醇和乙醇
不溶于：苯、yi醚和丙酮
二、使用方法
材料：1g PEI 25K™线性聚乙烯亚胺转染试剂（23966-1）、1L 纯水、12 M盐酸、10M氢氧化钠、一次性 0.1-0.2µm PES 真空无菌过滤器、无菌高聚乙烯或聚丙烯试剂瓶。
器材：1 L 玻璃烧杯、1 L 玻璃量筒、核准 pH 计、2 支 1 mL 塑料移液管、托盘、聚四氟yi烯（PTFE）搅拌棒、真空泵配制过程：
1. 取1g PEI 25K™线性聚乙烯亚胺转染试剂（23966-1）溶于900ml水中；
2. 加热到60-80℃并搅拌；
3. 加入HCl，调节PH 2.0；
4. 盖上烧杯，搅拌3h，直到PEI 25K™线性聚乙烯亚胺转染试剂（23966-1）粉末wan全溶解为止；
5. 冷却，直至室温；
6. 再加入NaOH ，调节pH 6.9-7.1；
7. 将调节好的溶液移到量筒中，加水至1L；
8. 真空过滤消毒；
9. 将消毒好的溶液进行分装，分装好的溶液在-20°C下 保存。
备注：加热/加酸都有利于 PEI 溶解。加酸的时候注意用量，多次少量，达到PEI wan全溶解即可。
试剂储存：冷冻部分溶液可在-20°C 保存长达一年；部分解冻的溶液可在 4°C 保存2 周，注意不可反复冻融。
粉末储存：未开封的粉末有效期两年。可在室温下保存直至使用。
以上就是有关于polysciences 23966-1使用方法的全部内容解答，如果你想了解更多请咨询上海金畔客服。


polysciences 24765-1的使用方法

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polysciences 24765-1的使用方法

PEI MAX 40K，又称为polysciences 24765-1，是一种可用于体内和体外转染实验的线性聚乙烯亚胺盐酸盐试剂。它具有强大、可靠且经济高效的特点。由于其高密度可质子化氨基基团，它能够在几乎任何pH值下保持细胞内环境的稳定性，从而促进遗传物质从内吞体释放至细胞质。该试剂能够与DNA形成稳定的复合物，并成功进入细胞并逃逸内吞体，成为一种高效的转染试剂，适用于多种细胞系/类型，包括常见的HEK293和CHO细胞。
polysciences 24765-1的使用方法如下：
1. 将1克polysciences 24765-1加入900毫升水中，并放入1升容量烧杯中。
2. 使用带有聚四氟乙烯涂层的搅拌棒，在适当的搅拌速度下开始搅拌。
3. 等待polysciences 24765-1溶解，通常需要大约5分钟。
4. 使用25毫升塑料移液管将1N氢氧化NA滴入1升容量烧杯中，直到pH值达到6.90至7.10之间。
5. 如果pH值意外超过7.10，可以使用1N盐酸和新的25毫升塑料移液管，将pH值调整至6.90至7.10之间。
6. 将溶液转移到1升容量瓶中。
7. 添加适量水使容量达到1升，并进行定容。
8. 使用真空膜过滤，获得无菌溶液。
9. 将溶液分装成小容器，并存放于4°C下保存。
总结起来，Polysciences 24765-1是一种线性PEI MAX转染试剂，通过遵循正确的步骤和条件，可以实现高效的基因转染和表达，为后续的实验和研究提供有力支持。
以上就是有关于polysciences 24765-1的使用方法的全部内容，如果你想了解更多请咨询客服。

流式细胞术的样品制备方法

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流式细胞术的样品制备方法

　　流式细胞术的测定对象是单细胞或单个微粒，在FCM技术中能够制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节，单细胞悬液来自于动植物的不同组织器官，也可来自于非生物样品，FCM中大多数为生物样品，生物样品主要来源于培养细胞、血液、新鲜实体组织以及石蜡包埋组织等，不同的组织有不同的单细胞分散方法，因此建立切实可行的FCM单细胞悬液的具体制备方法，在流式细胞分析中至关重要。那么你知道流式细胞术的样品制备方法都有什么吗？让我们一起来看看吧！
 
　　一、酶消化法
 
　　酶的作用原理主要有三方面：一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质，三是水解组织间的粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。
 
　　二、机械法
 
　　机械法分散实体组织包括:用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，用细注射针头反复抽吸细胞等，最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。
 
　　三、化学处理法
 
　　化学处理法的主要原理是:将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。
 
　　四、注意事项：
 
　　1. 需要注意的是酶学方法的使用条件和影响因素(如酶浓度、酶效价、作用时间、pH值)等，例如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性、胰酶在中性溶液中活性欠佳。
 
　　2. 采用网搓法同样也可获得大量细胞，但机械法容易造成细胞碎片和细胞团快，因此常与其他方法配合使用。
 
　　3. 新鲜组织标本应及时处理保存，避免细胞自溶导致DNA降解。
 
　　4. 根据实验目的选择最佳固定方式;如采用酶学法需注意酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等，同时根据组织成分合理选用酶类，例如含大量结缔组织肿瘤，如食管癌、乳腺癌、皮肤癌等应选择胶原酶。
 
　　更多有关流式细胞术的样品制备方法，请联系上海金畔生物科技有限公司。

DNA的浓度和纯度检测方法

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DNA的浓度和纯度检测方法  你知道DNA的浓度和纯度的检测方法有什么吗？让我们一起来看看吧！

目前常用紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度。

一、检测原理

紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50ug/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33ug/ml，RNA约为40ug/ml，寡核苷酸约为35ug/ml。如用H，O稀释DNA/RNA样品n倍并以H，O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度

二、DNA纯度比值

DNA 纯度比值是表示DNA样本中 DNA 的相对浓度的指标，它是通过测量样本中不同物质的含量来计算的。A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。

三、DNA纯度比值可能受到以下因素的影响

1. 样本收集和存储方法：样本在收集和存储过程中可能会受到污染，影响DNA纯度。

2. DNA 提取方法：不同的DNA提取方法可能导致DNA纯度的不同。

3. 生物样本的特性：不同的生物样本中的DNA含量和组成也可能导致DNA纯度的不同。

4. 纯化步骤：在纯化DNA时，不同的纯化方法和操作步骤可能对DNA纯度产生影响。

5. 测量方法：不同的测量方法可能产生不同的DNA纯度比值。

因此，为了确保DNA纯度的准确性，需要在每个步骤中注意控制可能影响DNA纯度的因素，并使用适当的方法和技术进行测量。

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培养基的保存要求及方法

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培养基的保存要求及方法

　　培养基的保存要求及方法
　　你知道培养基的保存要求及方法吗？让我们一起来看看吧！
　　一、培养基保存要点总结
　　1.已开封的干粉培养基需放置避光、阴凉、干燥处密封保存。
　　2.制备好的培养基如不立即使用，建议放置低温、避光处保存，必要时需放置2-8℃冰箱低温保存。
　　3.多数平皿最佳保存温度为15-20℃，温度过低易出冷凝水，温度过高平皿易失水，含有不稳定成分的平皿建议放置2-8℃保存。
　　4.保存的培养基可在验证过的有效期内使用，一般含不稳定成分的培养基可在一周内使用，成分稳定的培养基可保存2-4周或更长时间，如发现有污染、失水、变色等现象则不可使用。
　　二、制备好的培养基如何进行保存
　　1.含有琼脂的培养基，不可冷冻保存。结冰会破坏琼脂结构，出现皱缩现象。在使用冰箱冷藏平皿时，要避免接触制冷的位置。
　　2.含有染料的培养基（如煌绿乳糖胆盐肉汤、XLD等），需避光保存。光照会导致部分染料分解褪色。
　　3.需加入添加剂的培养基（如Baird-parker琼脂、PALCAM琼脂等），可将灭好菌的基础培养基保存，临用前加热溶化再加入添加剂；若已加入添加剂，视添加剂的稳定性确定保存期限。
　　4.制备好的平皿若要冷藏较长时间，需密封保存，防止水份过度散失。
　　5.特殊培养基在保存后需经处理再使用（如硫乙醇酸盐流体培养基需加热驱氧）。
　　6.加热煮沸灭菌的培养基，需严格按照标准规定使用，不宜久存。如亚硫酸铋琼脂、XLD琼脂等，宜当天配制第二天使用，存放不超过48h。
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细胞培养的常见问题及解决方法

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细胞培养的常见问题及解决方法

　　你知道细胞培养的常见问题及解决方法吗？让我们一起来看看吧！
　　一、培养细胞不贴壁
　　原因：
　　1.胰蛋白酶消化过度；
　　2.支原体污染；
　　解决方法：
　　1.缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度；
　　2.分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物；
　　二、悬浮细胞成簇
　　原因：
　　1.培养液中含钙,镁离子；
　　2.支原体污染；
　　3.蛋白酶过度消化使得细胞裂解；
　　解决方法：
　　1.用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻巧吹吸
　　2.细胞获得单细胞悬液；
　　3.分离培养物，检测支原体；
　　三、培养细胞生长缓慢
　　原因：
　　1.由于更换不同培养液或血清；
　　2.培养液中一些细胞生长必须成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏；
　　3.培养物中有少量细菌或真菌污染；
　　解决方法：
　　1.比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养液；
　　2.换入新鲜配置培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子；
　　3.用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物；
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细胞转染的分类方法

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细胞转染的分类方法

　　细胞转染是指将外源性基因导入到细胞内的技术。那你知道细胞转染的分类方法是什么吗？让我们一起来看看吧！
　　一、根据导入的核酸存在的时间长短，可分为瞬时转染和稳定转染
　　瞬时转染：指将构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内，该质粒上的外源基因不整合到细胞自身的基因组上。
　　细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。多用于启动子和其他调控元件的分析。
　　稳定转染：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。与瞬时转染不同，稳定转染能够整合到宿主基因组，因此转染细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留转染的DNA。
　　由于稳转效率较低，因此选用有效的细胞转染方法很重要。
　　二、根据转染方式可以分为化学，生物，物理方法
　　化学方法：利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷。如阳离子脂质体方法、磷酸钙共沉淀法、其他阳离子物质介导等技术。
　　生物方法：利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中。现在比较多见的是各种病毒介导的转染技术。
　　物理方法：在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA。如电穿孔法、显微注射法。
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ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么？

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ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么？

酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。那么你知道ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、高背景或阴性对照只偏高

原因：

1. 阴性对照孔被阳性对照货样品污染

2. 抗体非特异性结合

3. 酶结合物过浓

4. 孵育温度过高

解决方法：

1. 洗涤是，勿将洗液溢出孔外

2. 封闭液不合适，更换封闭液

3. 请检查酶结合物是否按说明书规定稀释

4. 检查孵育箱的温度是否正确、稳定

二、标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号

原因：

1. 样本中无检测物或检测无含量极低

2. 样本中其它物质影响/掩盖检测

3. 样本中检测物浓度过高，HOOK效应导致假低值

解决方法：

1. 设置内参，重新实验

2. 作适当稀释，降低其它物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率

3. 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内

三、重复性较差

原因：

1. 微孔中有气泡

2. 试剂未混匀

3. 样本中有杂质或沉淀物

4. 微孔包被面被吸头划破

解决方法：

1. 用针尖挑破气泡

2. 确保充分混匀试剂

3. 使用前；离心

4. 加液是小心操作

四、假阳性反应

原因：

1. 洗涤不充分

2. 洗板机管道堵塞

3. 加结合物是，洒在微孔边缘

解决方法：

1. 使用前需检查洗板机是否正常工作

2. 需经常维护洗板机

3. 小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触

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常见的RNA提取方法

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常见的RNA提取方法  不同组织RNA提取原理是将细胞裂解，释放出 RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA 等杂质，最终获得高纯度 RNA 产物的过程。那么你知道常见的RNA提取方法有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、酚氯仿抽提（有机试剂抽提）

原理：将被裂解的生物样本，混匀离心分相以后，RNA在上层水相，DNA，蛋白质在中间层，下层有机相。收集水相加入乙醇或异丙醇可沉淀RNA，漂洗后得到RNA。

优点：得率高、可提取到含miRNA和其他小RNA在内的总RNA。

缺点：用到苯酚、氯仿等有毒试剂。

二、硅胶柱法抽提

原理：硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附核酸。（高盐低pH吸附核酸，低盐高pH释放核酸。

优点：操作简单、安全无毒

缺点：需配合高速离心机使用；提取的总RNA不含小于200nt的小RNA。

三、磁珠法抽提

原理：纳米微球磁珠材料表面涂上一层二氧化硅，使磁珠获得吸附能力。

优点：磁场中快速分离，无需离心，可实现自动化操作。

缺点：成本较高；提取的RNA可能残存磁珠。

更多有关常见的RNA提取方法，请联系上海金畔生物科技有限公司。

ELISA检测方法有哪些？

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ELISA检测方法有哪些？

根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件的不同，所使用的检测方法也不同，那么ELISA检测方法有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待测血清中的响应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后加酶标记抗体，与免疫复合物中的抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原的含量。

二、竞争法

首先将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。此方法测定的抗原只要有一个结合部位即可，对小分子抗原如激素和药物类的测定常用此法。

三、直接法

在直接Elisa中，抗原通过被动吸附直接固定在板的表面，并使用HRP标记的一抗进行检测。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。

四、间接法

间接Elisa本质上是直接ELISA的修改版本。在间接ELISA中，用于检测抗原的一抗是未偶联的。取而代之的是，对一抗的宿主物种具有反应性的酶标二级抗体被用于检测一抗-抗原复合物（间接检测抗原）。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。与直接ELISA相比，使用辅助检测试剂具有明显的优势，即信号放大。

更多有关ELISA检测方法的内容，请联系上海金畔生物科技有限公司：

ALZET渗透泵使用方法

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ALZET渗透泵使用方法

ALZET渗透泵有多种尺寸、持续时间和流量可供选择，以满足广泛的研究需求。当每种型号的渗透泵送速率在制造时是固定的时，可通过改变每台渗透泵中填充的药剂浓度来调整输送药剂的剂量。如果动物足够大，可同时植入多个泵，以获得比单泵更高的输送速率。对于更长时间的输送，泵可以连续植入，而不会产生不良影响。以下是ALZET渗透泵的使用方法。

一、确定所需浓度

配制供试品溶液的主要目的是浓缩药物溶液，以便将其装入给定泵中时，动物将获得所需剂量。

ALZET渗透泵设计用于以恒定速率输送固定体积的试验溶液。配制供试品溶液的第一步是确定您希望提供的供试品的剂量或每小时质量流量。要将质量流量减半，使用一半浓度；为使质量流率加倍，使用两倍的浓度等。泵可输送的试验材料的最高质量流率由试验剂在其载体（饱和溶液）中在装载温度（通常为室温或约23ºC）下的最大溶解度确定。泵输送的药剂量（µg/hr）可通过改变试验溶液中的药剂浓度进行调整。

二、选择载体

在规划特定化合物的管理时，选择最佳载体非常重要。溶剂的选择应包括以下内容：

1.待交付药剂的溶解度

2.与泵内部储液罐的兼容性

3.与给药部位组织或液体的相容性

4.化合物/载体溶液在实验期间的稳定性（如果可以，建议进行载体对照研究）

5.无菌

三、复合稳定性

只有当供试制剂在输液期间在体温下的溶液中稳定，才能获得长期、恒定的供试制剂。虽然使用无菌溶液很重要，特别是如果试验材料是微生物的潜在底物，但选择具有正确特性的载体也同样重要。一些考虑因素包括pH值、离子强度、氧化还原电位等。一些抗氧化剂、缓冲剂和类似化合物可能足以稳定，但必须根据经验而不是理论依据进行选择。咨询工业或医院药剂师，或试验制剂制造商，以获得最佳配方方面的帮助可能会有所帮助。

作为评估试验材料在37°C下稳定性的初步方法，首先用无菌材料填充小型无菌试管并盖紧。在37°C下培养计划实验的预期持续时间，并分析比活性。将活性与新制样品的活性进行比较。如果相应的活动是等效的，则试验材料在上述条件下是稳定的。如果载体与泵储液罐相容，则使用上述试验获得的试剂稳定性的阳性结果可能表明泵内的稳定性。但是，建议稳定性试验包括体外泵送速率试验，以最终确定泵内试验材料的兼容性。

更多有关ALZET渗透泵的使用方法，请联系上海金畔生物科技有限公司：

细胞的处理与采集方法是什么？

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细胞的处理与采集方法是什么？

采集方法和处理是获取细胞来源后的关键步骤，它们直接影响到细胞的质量和活力。那么你知道细胞的处理与采集方法是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、采集方法：

1.骨髓穿刺：通过骨髓穿刺针将针头插入骨髓腔，通常在骨盆骨骼或胸骨等部位进行。这种方法适用于骨髓来源的细胞，如造血干细胞。

2.外周血采集：通过外周静脉或动脉采集患者的整个血液。这种方法适用于外周血来源的细胞，如外周血造血干细胞。

3.脂肪抽取：通过脂肪组织的吸取来获取脂肪来源的细胞，如脂肪干细胞。这种方法通常使用吸脂器来抽取脂肪组织。

4.细胞培养：一些细胞需要事*行细胞培养才能获取足够数量的细胞。这包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞等。

二、采集后的处理：

1.细胞处理：采集的组织或血液可能包含其他非细胞成分，如细胞碎片、血液成分等，在处理前需要进行去除或分离。这可以通过离心、过滤、沉淀等方法进行。

2.细胞浓缩：有时，在采集的细胞含量较低或稀释的情况下，需要进行细胞浓缩来提高细胞数目。浓缩方法包括离心浓缩、过滤浓缩、离心膜过滤等。

3.细胞存活与损伤：细胞采集和处理过程中可能会导致细胞存活率下降或细胞损伤。因此，在采集和处理过程中需要采取适当的措施来保护细胞的存活和完整性，如控制温度、使用适当的缓冲液等。

在采集和处理过程中，应严格遵守相关的操作规范和卫生要求，确保细胞的质量和安全性。同时，根据不同的细胞来源和处理方法，需制定相应的实验方案和处理步骤，确保细胞采集和处理的有效性和可靠性。更多有关细胞的采集方法与处理问题，请联系上海金畔生物科技有限公司：

蛋白质纯化都有哪些方法？

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蛋白质纯化都有哪些方法？

蛋白纯化是指通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到宿主细胞，使其大量表达，再使用适当的纯化方法将其在体外纯化出来，从而获得高纯度、活性和产量的蛋白质。那么蛋白质纯化方法都有什么呢？让我们一起来看看吧！

一、凝胶过滤层析：

根据分子大小从混合物中分离蛋白质，不同蛋白的形状及分子大小存在差异，在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异，大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小越晚洗脱。

二、离子交换层析：

依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化，蛋白表面通常会均匀带有一定的电荷，在一定条件下可以与阳/阴离子交换柱结合。在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，与离子交换柱的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同。

三、疏水作用层析：

利用蛋白质的疏水性，蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。

四、亲和层析：

把待纯化的某一蛋白质（或在蛋白质上加上标签）的特异配体通过适当的化学方法共价连接到载体分子上，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的蛋白质与配体特异性结合，而其他蛋白质则不被结合，通过洗涤除去，被特异结合的蛋白质可以用含游离的相应配体溶液洗脱下来。

更多有关蛋白质纯化方法有关内容，请联系Biotoolomics蛋白质纯化代理商——上海金畔生物科技有限公司：

这些测序方法，你知道吗？

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这些测序方法，你知道吗？

测序，测的是DNA的序列，也就是测定DNA中脱氧核糖核苷酸的排列顺序，它是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号的一个过程，我们能从这些经过科学计算得出的数字信号中找寻到生命之间的奥秘。根据测序技术出现的时间以及读长、通量等特征，分为一代测序、二代测序、三代测序。下面的这些测序方法，你知道吗？让我们一起来看看吧！

一、一代测序

一代测序技术，也被称为Sanger测序。其利用了双脱氧核苷酸会终止PCR的原理。比如：一条序列为ATCGCTA，我们进行3次的双脱氧核苷酸，第一次加入双脱氧核苷酸A和正常的ATCG那么我们会得到下面两种序列，A、ATCGCTA。那么我们就知道碱基A在序列的第一个碱基和第7个碱基。同理运用双氧核苷酸T和C，就会得整个序列的对应碱基的位置BP信息。进而得到整条序列的ATCG的序列信息。当然这些都是由仪器进行检测的。一代测序的特点：速度快，但是一次只能测一条单一的序列，且最长也就能测1000-1500bp。所以被广泛应用在单序列测序上。简单概括就是，一代测序只能测一条长度在1000bp左右的序列。广泛应用于单条序列的突变位点检测。

二、二代测序

二代测序技术，也被称为高通量测序技术。它解决了一代测序只能测一条序列的缺陷。随着科研的不断深入，我们开始分析一个物种或样本中的所有序列信息，这个时候一代测序一次测一条的方式就无法满足我们的需求。二代测序技术就是在这样的情况下诞生的。之所以称其为高通量测序就是因为它一次能够同时测很多的序列。我们通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库（这里就不深入建库的原理了）富集了这些DNA片段。接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。

二代测序特点：一次能够测大量的序列，但是片段被限制在了250-300bp，由于是通过序列的重叠区域进行拼接，所以有些序列可能被测了好多次。由于建库中利用了PCR富集序列，因此有一些量少的序列可能无法被大量扩增，造成一些信息的丢失，且PCR中有概率会引入错配碱基。所以三代测序就这样诞生了。

三、三代测序

三代测序其实就是对二代测序的一个升级，简单来说就是它同样一次能测好多序列，但是测序的长度达到了10kb左右，并且不需要PCR富集序列，直接测序，这就解决了信息的丢失，以及碱基错配的问题。但目前来说三代测序依然有一定的缺陷：三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性，且成本很高，极大地高于二代测序技术的错误率不过好在三代的错误是wan全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本）。

二代测序和三代测序统称为高通量测序，又称“下一代测序”或“深度测序”。

更多有关测序方法，请联系测序代理商——上海金畔生物科技有限公司：



Elisa的检测方法有哪些？

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Elisa的检测方法有哪些？

酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

Elisa的检测方法有哪些？让我们一起来看看吧！

常见的有直接法、间接法、竞争法基双抗夹心法，其中直接法和竞争法应用较少，应有最多的是双抗夹心法，让我们一一来看看它们是如何操作的吧！

 一、直接法

将抗原固定于ELISA班上，然后用酶标抗体直检测抗原。相较于其他类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，检测结果不容易出错，但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA版结合，实验背景会比较高，而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。

二、间接法

将抗原固定于ELISA班上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体于抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。于直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济，间接ELISA还提供了更大的灵活性，该方法的缺点有：存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。

三、夹心法

被检测的抗原包被再两个抗体之间其中一个抗体将抗原固定于载体上，即捕捉抗体，另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量，或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量，这两种抗体必须小心选取，才可以避免交互反应货竞争相同额抗原结合部位。

四、竞争法

预先将抗原包被再固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体，实验是，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原于预先包被再固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体，如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被再固相载体上的抗原，通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。竞争法相对以上的三种方法更复杂一些，但以上三种方法都适用于竞争法，其主要有点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。

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