这些测序方法，你知道吗？

测序，测的是DNA的序列，也就是测定DNA中脱氧核糖核苷酸的排列顺序，它是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号的一个过程，我们能从这些经过科学计算得出的数字信号中找寻到生命之间的奥秘。根据测序技术出现的时间以及读长、通量等特征，分为一代测序、二代测序、三代测序。下面的这些测序方法，你知道吗？让我们一起来看看吧！

一、一代测序

一代测序技术，也被称为Sanger测序。其利用了双脱氧核苷酸会终止PCR的原理。比如：一条序列为ATCGCTA，我们进行3次的双脱氧核苷酸，第一次加入双脱氧核苷酸A和正常的ATCG那么我们会得到下面两种序列，A、ATCGCTA。那么我们就知道碱基A在序列的第一个碱基和第7个碱基。同理运用双氧核苷酸T和C，就会得整个序列的对应碱基的位置BP信息。进而得到整条序列的ATCG的序列信息。当然这些都是由仪器进行检测的。一代测序的特点：速度快，但是一次只能测一条单一的序列，且最长也就能测1000-1500bp。所以被广泛应用在单序列测序上。简单概括就是，一代测序只能测一条长度在1000bp左右的序列。广泛应用于单条序列的突变位点检测。

二、二代测序

二代测序技术，也被称为高通量测序技术。它解决了一代测序只能测一条序列的缺陷。随着科研的不断深入，我们开始分析一个物种或样本中的所有序列信息，这个时候一代测序一次测一条的方式就无法满足我们的需求。二代测序技术就是在这样的情况下诞生的。之所以称其为高通量测序就是因为它一次能够同时测很多的序列。我们通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库（这里就不深入建库的原理了）富集了这些DNA片段。接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。

二代测序特点：一次能够测大量的序列，但是片段被限制在了250-300bp，由于是通过序列的重叠区域进行拼接，所以有些序列可能被测了好多次。由于建库中利用了PCR富集序列，因此有一些量少的序列可能无法被大量扩增，造成一些信息的丢失，且PCR中有概率会引入错配碱基。所以三代测序就这样诞生了。

三、三代测序

三代测序其实就是对二代测序的一个升级，简单来说就是它同样一次能测好多序列，但是测序的长度达到了10kb左右，并且不需要PCR富集序列，直接测序，这就解决了信息的丢失，以及碱基错配的问题。但目前来说三代测序依然有一定的缺陷：三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性，且成本很高，极大地高于二代测序技术的错误率不过好在三代的错误是wan全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本）。

二代测序和三代测序统称为高通量测序，又称“下一代测序”或“深度测序”。

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关于血清的这些知识，你了解吗？

• 什么是血清

血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆。

• 血清在细胞培养中的作用

血清的成分多样，可以给细胞提供：

1. 基本营养物质，如氨基酸、维生素、脂类物质、无机物、核酸衍生物等细胞生长必需的物质；

2. 激素：胰岛素、促生长激素、类固醇激素如睾酮和孕酮、肾上腺皮质激素如地塞米松等。

3. 生长因子：表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板生长因子、神经细胞生长因子等；

4. 结合蛋白：结合蛋白在细胞代谢过程中起着重要作用，它能携带重要地低分子量物质，如转铁蛋白结合铁离子，白蛋白携带维生素、激素等；

5. 促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤；

6. 蛋白酶抑制剂：中和某些细胞(如内皮细胞等)释放的蛋白酶，从而对培养中的细胞起到某些保护作用；

7.血清含有的一些微量元素和离子在代谢解毒中起重要作用，如SeO₃，硒等；

8.血清蛋白使血清具有一定的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，如悬浮培养搅拌时保护细胞。

• 常用的血清

目前常用的血清有胎牛血清、新生牛血清和小牛血清。

以上三种血清中胎牛血清的品质ZUI高，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，因此价格也最高。

• 血清的使用与选择

血清的使用浓度一般在5%~20%，常用是10%。

有些细胞需要胎牛血清才能生长，而有些细胞有小牛血清就能生长。因此，要根据具体用途与需要选择合适的血清。

• 血清的储存与解冻

1.储存：建议将血清储存在-5℃~-20℃（HyClone胎牛血清建议储存在-10℃）。注意：建议不要将血清储存在-80℃中！（因为储存在–80℃，解冻时巨大的温差会使血清产生更多的沉淀。）

2.解冻：不建议于4℃过夜解冻，也不建议直接将冷冻的血清放在37℃水浴或者温箱中解冻，因为若血清没有混匀，底部的蛋白会变性形成沉淀。

血清解冻的方法（三步法）如下：

注：在水浴过程中，血清要*浸入水中，同时在融化过程中要慢慢摇动瓶身混匀血清，但在摇动中尽量不要产生泡沫。

血清在解冻后，可以根据实验需求分装成单次用量，密封好后立即放回-20℃冰箱继续储存以供进一步使用，这样可以有效避免反复冻融的问题。

• 血清出现沉淀或絮状物质的原因

1. 2-8℃长时间储存。

2. 解冻过程中未混匀。

3. γ–辐照：不会损害血清的理化特性或细胞培养性能。

4. 反复冻融：使血清脂蛋白发生变性造成浑浊。

5. 血清中残留的纤维蛋白原：残留的纤维蛋白原在解冻后会转化为纤维蛋白，过量的纤维蛋白在血清中表现为可见的絮状物质。

去除方法：400 g离心。不建议直接过滤血清以去除絮状物质，因为过滤器可能会堵塞或者截留重要的蛋白质。

6. 磷酸钙：磷酸钙在血清中通常呈云状，并且在倒置显微镜下观察会看到可以自由移动的小黑点，因此磷酸钙沉淀通常被误认为是微生物污染物。

检测是否污染方法：将1 mL待测血清直接倒在细菌琼脂平板上，在37℃培养之后观察菌落的生长情况。在油镜（放大1000倍）下观察革兰氏染色，以确定是否受到污染。不建议用37℃孵育的血清直接检测无菌性，因为在37℃孵育之后，血清中的磷酸钙沉淀物会增加。

• 国内购买胎牛血清的现状

难辨真假，产地不实，有的甚至都不是牛血清。非正规胎牛血清产品会直接影响实验的结果和稳定以及数据的真实性，对实验造成很大的影响。因此，购买血清产品时一定要选择可靠的产品！

上海金畔生物科技有限公司提供来源可靠，产地可查的HyClone、Omnimabs以及澳申生物的血清产品。

• HyClone新西兰源胎牛血清产品优势：

1.「真混合」生产工艺，确保批内一致性；

2.采用一次性生产设施，*消除了交叉污染的风险；

3.最DA的批处理能力，降低批间差异造成的影响；

4.完整的来源地可追溯性；

5.低抗体含量，高生长因子；

6. Oritain^TM天然品指纹识别技术；

• Omnimabs南美胎牛血清产品优势：

1. 合法进口于无疯牛病疫区，具有合法的进口批文、海关证明以及检验检疫证明；

2. 百分之BAI原装血源；

3.采血点集中，生产工艺*，批次稳定；

4.符合GMP车间要求，满足工业客户的需要。

• 澳申生物新生牛血清产品优势：

1.国家批准的血源地，血清均可追溯源头，一瓶一码；

2.国际先JIN生产工艺：3级0.1 μm过滤，标准净化车间，万级环境下罐装，全程低温控制系统；

3.国内双重质检，全面理化、微生物检测，不含BVDPI3IBRRABVBAV BRSVBTV等牛病病毒。