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qPCR实验常见问题及解决方法

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qPCR实验常见问题及解决方法  PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。可以在短时间内将微量的DNA片段扩增到足够数量，用于后续的研究和检测。下面让我们一起来看看qPCR实验的常见问题及解决方法吧！

一、扩增曲线不稳定

可能原因

RNA纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。

解决方案

1）提取高纯度的RNA，小心操作。

2）对仪器进行校准。

二、扩增无法达到平台期

可能原因

模板浓度太低；循环数太少；试剂扩增效率低。

解决方案

1) 提高模板量

2) 提高循环数

3) 用标准曲线测定扩增效率，提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂。

三、荧光下降

可能原因

存在降解；模板浓度过高。

解决方案

1) 提高体系纯度

2) 降低模板量

3) 降低荧光阈值

四、单峰、峰不尖锐

可能原因

与试剂成分有关；或存在大小相近的非特异性扩增。

解决方案

1) 温度跨度不高于7度，视为可用结果

2) 进行高浓度琼脂糖电泳，确认是否为单一条带。

五、单峰，Tm低于80度

可能原因

只有引物二聚体，无目的条带；或扩增片段过短。

解决方案

1) 检查是否加入模板

2) 进行琼脂糖电泳检测，确定条带大小是否正确

六、双峰，较低峰Tm在80度之前

可能原因

由于模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成引物二聚体。

解决方案

1) 适当提高退火温度

2) 提高模板量，降低引物浓度

3) 重新设计引物。

七、qPCR注意事项

·提高样品纯度，尽量减少样品之间的交叉污染。

·每个样品至少要做3个平行孔，以防在 后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。

·MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好融解后放 在4℃；配置体系时在冰上操作；减少加样误差，每管或每孔都要换新枪头，不要连续用同一个枪头加样；所有成分加完后，离心去除气泡。

更多有关qPCR实验常见问题及解决方法，请联系上海金畔生物科技有限公司。

WB实验中出现不同情况的条带问题怎么解决呢？

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WB实验中出现不同情况的条带问题怎么解决呢？

Western blot是一个非常基础的实验，但是着实让我们头疼，即使是老手也挡不住WB实验的千锤百炼，懂得都懂，当WB实验中出现不同情况的条带问题怎么解决呢？，我们一起来探讨一下，希望对正在做WB实验的小伙伴提供一个避雷参考！

情况一：条带呈笑脸状

1.迁移过快或电泳温度过高：降低电压或低温电泳。

2.配胶问题，凝胶不均匀冷却，中间冷却不好迁移过快：重新配胶，电泳槽老化换新。

情况二：条带呈皱眉状 

配胶问题，可能是装置不合适特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡或者凝胶两边聚合不wan全。

情况三：条带弥散或拖尾

1. 蛋白上样量过多：降低上样量。

2. 电泳结束后未立即转膜：电泳后尽快转膜。

3. 蛋白降解：加入蛋白酶抑制剂。

4.样品核酸污染：可进行超声及核酸酶处理或样品有不溶物，可稀释，充分裂解或离心操作。

情况四:条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜。

情况五：条带向两边扩散，不完整

1.抗体孵育不均一，或未充分结合：增加抗体孵育时间，建议4℃过夜孵育。

2.抗体浓度偏低：使用高浓度抗体。

3.化学发光液未加均一：适当增加化学发光液的量。

4.反应时间不够：增加化学发光显色反应的时间。

情况六：条带空心

可能由于蛋白浓度过高导致的底物消耗完毕，建议稀释样本浓度。

情况七：条带有不均匀的污点

1.膜上有气泡：转膜时将PVDF膜慢慢贴胶上后，可以用玻璃棒轻轻滚动，以驱赶膜与浇之间的气泡。

2.设备污染：确保设备清洗干净。

3.孵育或洗涤溶液不足，确保孵育洗涤充分。

4.封闭液未混匀，确保混匀，使用新鲜的封闭液，避免颗粒不溶物。

5.膜被污染：实验操作人员戴手套和口罩，穿实验服，保持膜的干净。禁止用手直接触摸膜。

情况八：深背景出现白色反光条带

中心部位高浓度 HRP 将底物消耗过快，中间部位底物消耗完后无法发光。

1.蛋白上样量过多：降低蛋白上样量。

2.一抗二抗浓度过高：适当加大抗体稀释。

情况九：哑铃型条带

1. 配胶问题，可能拔胶时用力过猛，导致胶变形突起：重新配胶。

2. 蛋白质有杂质。

情况十：出现非均一性背景，脏乱

膜可能曾经干过：可在实验过程中要保证膜一直处于湿润状态。

以上就是有关于WB实验中出现不同情况的条带问题怎么解决的问题解答，如果您有更多关于WB实验条带问题想咨询请给上海金畔留言，我们会第一时间给您回复！

细胞铺板不匀的解决方法有哪些？

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细胞铺板不匀的解决方法有哪些？

细胞接种铺板作为体外药理实验中最基本的技能，是实验成败的关键因素。铺板不匀又是科研实验中通往成功道路的一大障碍，细胞聚集导致的接触抑制现象使实验数据的可信度大打折扣。本片文章将会介绍细胞铺板不匀的解决方法有哪些？一起来跟小编涨知识吧！

对于96孔板，每孔通常加入100μL细胞悬液。加样方式为倾斜枪头，从孔的左边靠近底部缓慢加入（加样过快同样容易导致细胞聚集）。笔者建议，每加完半拉板子时，把细胞重新混匀，继续加样。加样结束后，镜下观察如有局部不均匀现象，可以采取敲击法，具体操作如下：将板子置于台面上，左手持住板子的左边，右手轻轻敲击板子的右边缘(5-8次)，力度太强或次数太多会反而更易导致细胞聚集。将板子顺时针旋转，依次敲击剩余三个边（据说逆时针效果不好），静置约5-10分钟后，放入37℃培养箱。

对于6孔板、12孔板或24孔板，为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常每孔首先滴加少量培基，轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子的孔底都是湿润的，这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底，可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象，细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下（5-10分钟）。镜下观察细胞均匀度，如不均匀可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度处理。具体操作如下：

 方法一(8字法)：这种方法也是大家最常见的细胞摇匀方法。横向8字摇匀法参考下图，摇动次数根据镜下观察和个人力度具体分析（参考：保证液体不被晃动出去，8字晃动5次理论上就可以基本晃匀）。摇匀结束，切忌在镜下移动观察视野太久，以免伴随着轻微的移动，细胞又往中间聚集。

方法二(十字法): 细胞铺完板后，在水平方向上，上下左右四个方向进行移动，呈十字形状，重复5-6次。有些同学觉得十字法摇匀效果并不好，方法关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的移动（也有同学建议可以在培养箱中摇匀）。另外，同样不建议放到镜下长时间去观察。

方法三(十字类似法)：细胞铺完板后，放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向5-6次。其他具体操作同十字法。

方法四(震荡法)：细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。（个人不太推荐这种方法，板子接触振荡器后增加了染菌的风险，而且转速的调节和时间的掌握比较困难）。
以上就是有关于细胞铺板不匀的解决方法有哪些的问题解答，如果你有更多问题请咨询上海金畔客服哦！

1640培养基出现沉淀怎么解决？

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1640培养基出现沉淀怎么解决？

1640 培养基最初为培养小鼠白血病细胞而制备。因为其组成简单，可以适应很多种类细胞的生长，主要用于悬浮细胞培养。可适用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养。那么你知道1640培养基出现沉淀怎么解决吗？让我们一起来看看吧！

1. 检查培养基成分：确认所使用的培养基成分是否正确。检查培养基配方，并确保每种成分的质量和纯度符合要求。使用质量较高的试剂可以降低不溶性物质的含量。

2. 调整pH值：沉淀可能是由于pH值过高或过低引起的，偏酸或偏碱的pH有可能使培养基中的部分金属离子产生沉淀。检查培养基的pH值，并根据需要进行调整。使用缓冲液来稳定pH值，确保它在适当的范围内。

3. 过滤培养基：将培养基过滤可以去除其中的不溶性物质和沉淀。使用合适的滤器（如0.22微米滤器）将培养基过滤，以去除不需要的颗粒和固体物质。

4. 使用纯化水、去离子水：多数培养基的制备需要使用纯化水、去离子水配制，而天然水中含有含有较多的矿物盐离子，若错误的使用了自来水，矿泉水配制，或使用的纯化水离子未除净，都有可能导致培养基灭菌后出现浑浊现象或沉淀。确保使用纯化水、去离子水，如去离子水或经过滤的蒸馏水。这样可以减少不溶性物质的含量，从而降低沉淀的风险。

5. 热处理：通过加热培养基可以溶解其中的不溶性物质。将培养基加热至适当温度（通常为80°C至90°C）并搅拌，以帮助溶解沉淀物。之后冷却并过滤培养基。

6. 检查培养器具：检查用于制备和保存培养基的容器和器具。确保它们是干净的，并且没有残留物或杂质。使用清洁的容器和试管，并使用洁净的培养工具。

7. 加入螯合剂：螯合剂可以帮助溶解或稳定沉淀物。根据具体情况，添加适当的螯合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二胺四乙酸乙二酯）。

更多有关1640培养基出现沉淀的解决方法，请联系上海金畔生物科技有限公司。

Alzet渗透泵里面有气泡怎么解决？

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Alzet渗透泵里面有气泡怎么解决？

Alzet渗透泵是一种小型、可植入式的胶囊，可应用于小鼠、大鼠及其他实验动物研究。该胶囊无需进行外部连接或频繁处理，就能以恒定的速率持续给药一天到四周的时间。胶囊中有气泡会导致不可预测的药物泵送率波动。那么你知道Alzet渗透泵里面有气泡该怎么解决吗？让我们一起来看看吧！

以下是可能导致ALZET渗透泵产生气泡的一些原因：

1. 不正确的装配：如果泵的部件没有正确组装，例如注射器和与其连接的灌装管没有正确安装，可能会导致气泡产生。

2. 液体过热：如果注入到泵中的液体过热，会导致液体中的气体变成气泡。这可能是由于使用过热的溶液或在注入液体时未充分冷却引起的。

3. 液体不纯：如果注入到泵中的液体含有杂质或气体，这些杂质和气体可能会形成气泡。

4. 若使用较大注射器，由于灌装速度过快，可能会在胶囊中产生气泡。用注射器抽取药物溶液，装上灌装管。

解决方法：

1. 检查装配：确保泵的所有部件都正确组装，特别是注射器和与其连接的灌装管。检查泵的使用说明书以了解正确的组装步骤。

2. 使用合适的液体：使用适当温度的液体，并确保液体wan全冷却后再注入。避免使用过热的溶液。

3. 净化液体：在注入液体到泵之前，使用过滤器或其他净化方法来去除杂质和气体。

4. 检查泵的完整性：定期检查泵的外观，确保没有泄漏或损坏的部件。

5. 保持胶囊直立，缓慢推注射器的活塞。当药物溶液到达胶囊顶部小开口处停止灌注，小心移去灌注管，

更多有关Alzet渗透泵里面有气泡的解决方法，请联系Alzet渗透泵代理——上海金畔生物科技有限公司。

细胞培养的常见问题及解决方法

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细胞培养的常见问题及解决方法

　　你知道细胞培养的常见问题及解决方法吗？让我们一起来看看吧！
　　一、培养细胞不贴壁
　　原因：
　　1.胰蛋白酶消化过度；
　　2.支原体污染；
　　解决方法：
　　1.缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度；
　　2.分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物；
　　二、悬浮细胞成簇
　　原因：
　　1.培养液中含钙,镁离子；
　　2.支原体污染；
　　3.蛋白酶过度消化使得细胞裂解；
　　解决方法：
　　1.用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻巧吹吸
　　2.细胞获得单细胞悬液；
　　3.分离培养物，检测支原体；
　　三、培养细胞生长缓慢
　　原因：
　　1.由于更换不同培养液或血清；
　　2.培养液中一些细胞生长必须成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏；
　　3.培养物中有少量细菌或真菌污染；
　　解决方法：
　　1.比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养液；
　　2.换入新鲜配置培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子；
　　3.用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物；
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ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么？

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ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么？

酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。那么你知道ELISA的常见问题有哪些？解决方法是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、高背景或阴性对照只偏高

原因：

1. 阴性对照孔被阳性对照货样品污染

2. 抗体非特异性结合

3. 酶结合物过浓

4. 孵育温度过高

解决方法：

1. 洗涤是，勿将洗液溢出孔外

2. 封闭液不合适，更换封闭液

3. 请检查酶结合物是否按说明书规定稀释

4. 检查孵育箱的温度是否正确、稳定

二、标准曲标准曲线良好，但样本无检测信号

原因：

1. 样本中无检测物或检测无含量极低

2. 样本中其它物质影响/掩盖检测

3. 样本中检测物浓度过高，HOOK效应导致假低值

解决方法：

1. 设置内参，重新实验

2. 作适当稀释，降低其它物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率

3. 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内

三、重复性较差

原因：

1. 微孔中有气泡

2. 试剂未混匀

3. 样本中有杂质或沉淀物

4. 微孔包被面被吸头划破

解决方法：

1. 用针尖挑破气泡

2. 确保充分混匀试剂

3. 使用前；离心

4. 加液是小心操作

四、假阳性反应

原因：

1. 洗涤不充分

2. 洗板机管道堵塞

3. 加结合物是，洒在微孔边缘

解决方法：

1. 使用前需检查洗板机是否正常工作

2. 需经常维护洗板机

3. 小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触

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WB实验常见问题有哪些？如何解决？

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WB实验常见问题有哪些？如何解决？

Western Blot虽是实验室zui常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以导致在实验过程中会遇到各式各样的问题，那么你知道WB实验常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、目标条带没有信号

原因分析：

1.样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。

2.目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。

3.转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。

4.一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。

解决方法：

1.添加蛋白酶抑制剂。

2.加大上样量或提高目标蛋白浓度。

3.控制转膜时间并选择适合的转印膜。

4.选用高品质抗体。

二、图片背景过高，难以分辨条带

原因分析：

1.一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。

2.洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净

3.封闭物用量不足。

4.封闭物使用不当。

解决方法：

1.降低一抗浓度。

2.提高洗脱时间和频率。

3.提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液wan全浸没转印膜。

4.检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。

三、 膜上出现黑点和黑斑

原因分析：

1.抗体与封闭试剂反应。

2.HRP偶联二 抗中有聚集体。

解决方法：

1.使用前过滤封闭试剂。

2.过滤二抗试剂，去除聚集体。

四、出现非特异性条带

原因分析：

1.一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。

2.目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。

3.蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。

解决方法：

1.更换一抗。

2.更换一抗品种。

3.添加蛋白酶抑制剂。

五、条带粘连

条带粘连是不同孔目标条带连在一起，中间无间隔，如图所示。出现该现象的原因可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）

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核酸电泳实验问题有哪些？如何解决？

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核酸电泳实验问题有哪些？如何解决？

你知道核酸电泳实验问题有哪些吗？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、无条带或几乎看不到条带

原因：

1.上样染料掩盖目标条带；

2.凝胶超限运行；

3.电极反接；

4.染色敏感度低；

5.光源错误。

解决方法：

1.检查电泳中使用的加载染料的表观迁移大小。因为染料可能会掩盖和隐藏目标条带，特别是在样品量低的情况下。

2.监测加载染料的运行时间和迁移，以避免将较小的样品分子从凝胶上运走。

3.确保将电极正确连接至电源。设置水平凝胶时，凝胶孔应与负极位于同一侧。

4.检查制造商提供的用于检测核酸的荧光染色剂的灵敏度。

增加染色剂用量和/或延长染色时间，使单链核酸显色。或者，考虑对单链分子 具有 更高亲和力的du特染色，以提高检测的特异性和灵敏度。

对于较厚或高百分比凝胶，应延长染色时间，以确保荧光染色剂充分渗透。

5.如果使用荧光染料进行染色，请检查其激发波长以确保使用的光源对刺激染料进行可视化来说是最佳的。

二、条带拖尾或扩散（模糊）

原因：

1.上样孔形成不佳；

2.样品超载；

3.样品溶于高盐缓冲液；

4.样品含有大量蛋白质。

解决方法：

1.灌注凝胶前，应适当清洁凝胶梳。

不可将凝胶槽填充过满，否则会导致上样孔连接。

移除凝胶梳之前，应预留足够的上样孔形成时间。

2. 在凝胶电泳中，不可使用过量样品；每1毫米的凝胶孔宽度通常推荐0.1–0.2 μg的样品用量。而拖尾、弯曲或U形条带以及融合条带均是过载凝胶的常见表现。

3. 检查加载缓冲液的盐浓度是否与选定的凝胶兼容。如有需要，可稀释上样缓冲液。

4. 存在于样品中的蛋白质可能会干扰凝胶中的样品迁移率。通过纯化样品来去除蛋白质，或者通过在装有SDS的加载染料中制备样品并在加载之前加热来分离/变性蛋白质。

三、条带分离不佳

原因：

1. 未选择最佳的凝胶类型

2. 凝胶类型错误

3. 电压过低或过高

4. 电泳时间过短或过长

解决方法：

1. 选择更适合分离样品的凝胶类型。推荐使用聚丙烯酰胺凝胶来解析核苷酸<1,000 bp。

2. 对于单链核酸（例如RNA）的电泳，制备用于有效分离的变性凝胶。对于双链DNA的电泳，应避免使用变性凝胶，以保护双链结构。

3. 施加电压为建议的核酸的大小范围和使用的运行缓冲液。电压过低或过高，都无法实现最佳的核酸分离。

4. 足够长的运行凝胶以确保充分分离条带。但电泳时间不宜过长，否则会导致过度加热、样品变性和条带扩散。

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qPCR曲线常见问题有哪些？如何解决？

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qPCR曲线常见问题有哪些？如何解决？

在 qPCR 实验过程中，经常会遇到异常扩增曲线和熔解曲线的困扰，那么qPCR曲线常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、扩增曲线相关问题

1.无扩增曲线

可能原因：

（1）没有打开荧光信号采集。检查程序设置，三步法扩增程序在 72℃ 延伸阶段采集信号，两步法扩增程序的信号采集设置在退火延伸步骤。

（2）引物降解。可通过 PAGE 电泳检验引物的完整性。

（3）模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。

2. 扩增曲线不光滑

可能原因：

（1）仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器；

（2）RNA 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。

3. 扩增曲线平台期抖动

可能原因：仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。

4. 扩增曲线右下方下落呈倒扣状

可能的原因：模板浓度过高，基线终点值大于 CT 值，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 S 形（左图）。可适当减小基线范围，手动调整基线终点值至 CT 值 -4，调整基线范围后，扩增曲线即恢复正常（右图）。

二、熔解曲线相关问题

1. 有扩增曲线无溶解曲线

可能原因：检查是否有设置熔解曲线步骤或熔解曲线信号采集是否打开。

2. 熔解曲线杂峰

（1）杂峰在主峰之前

可能的原因：杂峰在主峰之前，Tm 在 70～75℃ 范围内，一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合，在 Taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 DNA 片段。可根据 NTC（无模板阴性对照）判断是否为引物二聚体。

解决方案：建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。

（2）杂峰在主峰之后

可能的原因：非特异性扩增，可能由于引物特异性较差，或体系中有气溶胶污染（可结合 NTC 确定体系是否有污染）。建议先提高退火温度，可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善，建议更换特异性较高的引物。

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如何解决病毒转染实验的常见问题？

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如何解决病毒转染实验的常见问题？

病毒转染是指将外源病毒导入真核细胞的技术，用病毒将带有目的基因的载体整合到细胞的基因组中，以达到长期稳定表达目的基因的目的，那么你知道该如何解决病毒转染实验的常见问题吗？让我们一起来看看吧！

一、转染效率低

可能是由于病毒感染的细胞数量不足、浓度太低、转染时间过短、细胞质量差等原因导致。可以尝试增加病毒的浓度和转染时间，或者优化细胞培养条件来提高转染效率。

解决方法：优化病毒载体和转染剂的选择和使用方法，调整细胞的培养条件和密度，增加转染时间和浓度等操作方案。

二、细胞毒性

病毒转染过程中产生的细胞毒性会直接影响细胞的生长和稳定性，甚至影响实验结果。需要注意选择合适的病毒载体和转染剂，并对细胞状态和密度进行调整。

解决方法：针对病毒转染产生的细胞毒性，可采用补充营养物质、调节培养基pH值或温度、添加保护剂等方式进行缓解。

三、重复感染

在进行病毒转染时，避免病毒的重复感染，可对细胞进行预处理和检测，尤其是对病毒拓展因子表达的细胞系进行特别注意。

解决方法：加强实验前的准备工作，避免重复感染的发生。例如，对细胞进行必要的预处理和检测，及时更换新鲜培养基，使用消毒材料等。

四、非特异性效应

外源DNA或RNA转染后，可能会影响宿主基因表达和细胞功能，出现非特异性效应。需要对目标基因进行严格的鉴定和筛选，以确保实验结果的准确性和可靠性。

解决方法：通过对外源DNA或RNA转染后基因表达的分析鉴定，筛选出特异性效应较好的目标基因，并进行进一步的实验验证和数据分析。

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细胞实验的常见问题有哪些？如何解决呢？

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细胞实验的常见问题有哪些？如何解决呢？

细胞培养做为生物学研究最基础的技术之一，可以说是渗透科研界的方方面面。那么细胞实验中的常见问题有哪些？应该如何解决呢？让我们一起来看看吧！

一、如何选用细胞系培养基？

优先根据细胞来源公司提供的培养条件，。一般建议不要随意更换培养基种类。细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用与原先提供的培养条件不同的培养基，可能造成细胞形态发生变化或无法存活，以及细胞的表型功能丢失。

二、细胞发生微生物污染时，应如何处理？

直接丢弃或更换，将未受污染的细胞转移至其它培养箱，并用消毒剂消毒培养器皿和超净台以及二氧化碳培养箱。如发生真菌霉菌污染，需用紫外灯照射整个细胞间，从而消除可能产生的孢子。同时排除使用试剂的污染，包括培养基和血清，可以空培试验。

三、为何培养基用一段时间后，颜色偏紫？

培养基随着多次开盖会使培养液 CO2 逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性从而变紫，尤其是剩余的培养基越少越容易变紫。可将培养瓶瓶盖旋松放入二氧化碳培养箱校正溶液 PH 值，过一段时间就会变回正常。变紫的培养基是可以继续使用的，培养细胞时在培养箱会自动恢复颜色。

四、细胞培养液变黄变浑，如何处理？

细胞培养液变黄多半是细胞密度过大，细胞增殖速度过快，产生大量酸性代谢废物，导致细胞营养不足。而培养液变浑多半是发生了细菌污染。出现这种情况应立即进行消化传代处理。

五、血清中出现的沉淀是什么，有影响吗？

① 纤维蛋白，是经常出现的较大沉淀物，可达到 1～2 mm，用肉眼可观察到；

② 胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质，是血清出现沉淀物的常见原因；

③ 磷酸钙，也是一种常见沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在 37 ℃ 培养时会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

这些沉淀对细胞的生长是没有影响的，如想去除沉淀，尽量采用离心方法，不建议使用过滤方法，因为会堵塞滤膜而且会造成污染的风险。

六、细胞支原体污染如何处理？

支原体污染是比较难去除的，特别容易复发，一般建议直接更换新的细胞，如特别精贵或重要的细胞可尝试使用四环素、大环内酯类抗生素（泰乐霉素）、喹诺酮类抗生素。

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细胞污染问题分析与解决

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细胞污染问题分析与解决

 

细胞污染问题分析解决

细胞转染时，细胞状态的好坏对转染效率有很大影响。细胞污染可能会导致细胞死亡，本文主要总结了细胞培养中常见污染现象和解决方法。

凡是对细胞生长有危害的成分或者造成细胞不纯的异物都视为污染。细胞污染根据污染源可以分为化学污染，物理污染和生物污染。本文主要描述微生物污染的现象及解决方法

微生物污染

1. 细菌：细菌污染常见的有大肠杆菌，葡萄球菌等。细菌污染较易发现，在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，培养液一般会在短时间内变黄，有时静置的培养液不混，稍加震荡，变会有很多混浊物漂起。显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。

处理：① 在培养液中加入相应的抗生素，能够预防绝大多数的细菌污染

②保证器皿、水充分灭菌，空气无菌，同时保证灭菌压力。
2、霉菌：霉菌的污染多数是白色念珠菌， 曲霉菌，酵母菌等。霉菌污染后培养液短期内依旧清亮不变浑浊，倒置显微镜下可看见细胞之间有交错的丝状，树枝状菌丝，漂浮在培养液中。念珠菌呈卵圆状，在细胞周边生长。细胞被霉菌污染后，仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。

           

处理：先确定污染物的种类：细菌、真菌还是支原体。如果是霉菌污染。迅速将污染细胞与正常细胞系隔离，并对实验中所用过的所有器皿工具消毒

3、支原体：支原体的大小介于细菌和病毒之间，是一种独立生活的微生物。对热敏感，对一般抗生素不敏感。支原体的形态多变，多吸附在细胞表面和细胞之间。电镜下观察，中心有高密度的密集颗粒，横断面与细胞微绒毛相似。

因国内的血清很多数都没有做支原体阴性检测，而支原体又是牛血清中常见的微生物之一。支原体污染细胞后，培养液轻微发生混浊．但细胞变化不显著，在细胞逐渐的培养中，细胞会慢慢死亡。

支原体污染检测：

荧光染色法：DNA和与DNA特异性结合的荧光染料结合，使得支原体的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

 

解决：① 抗生素排除法：支原体污染预防比解决好。如果不小心污染后，可加入高浓度抗生素（常规使用的5倍浓度）作用24-48小时，再换入常规培养液，但该法不保证有效。推荐用量：庆大霉素 200ug/ml ,四环素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。

2 加温除菌：支原体不耐热，可以对支原体污染的细胞热处理除菌。将支原体污染的细胞放置41度中作用10小时可杀死支原体。因高温对细胞本身也会产生一定影响，故热处理前需行预实验，确定对细胞影响小而能大程度的杀死支原体的时间。
4、黑蛟虫：黑胶虫污染后细胞中出现小黑点，高倍镜下可看见不规则的运动。培养液浑浊不明显，对细胞生长状态无太大影响。

解决：如果细胞出现黑胶虫污染，可增加细胞的接种密度，提高细胞存活率。当细胞生长状态很好时，黑胶虫的数量会降低。细胞培养过程中坚持要每天换液，并用缓冲液冲洗，能够大大降低黑胶虫的数量，可终消失，偶尔在镜下可见个别小黑点，但整体细胞培养和后续的细胞转染无影响。

细胞培养箱染菌清洗方法

用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右）。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，制霉菌素或放线菌素D或双抗都无法弥补，舍弃被污染细胞，并将环境*消毒。如果所有细胞都污染，可能是整体系统污染，检查所有培养基和器材，并重新灭菌。针对个别污染，先考虑操作问题，注意操作规范。