流式细胞术的科研应用有什么？

流式细胞术（FCM）是一种对处在快速流动中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。它集计算机技术、激光技术、流体力学、荧光标记技术、单克隆抗体技术、细胞免疫学于一体，按照细胞或生物颗粒的物理或化学性质，同时具有分析和分选细胞或生物颗粒的功能。那么你知道流式细胞术的科研应用有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、细胞凋亡检测

在正常细胞中，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）位于胞浆侧。细胞凋亡中期，PS 外翻。Annexin V 是一种 Ca2+ 依赖的对 PS 具有高度亲和力的磷脂结合蛋白，因此可以用荧光标记的 Annexin V 检测 PS 的外翻。凋亡末期，细胞膜结构受损，原本不透膜的核酸染料（如 PI、7-AAD 等）也能进入细胞，从而产生信号。分别检测 Annexin V 和不透膜核酸染料的信号，可对凋亡中期和末期细胞的比例进行定量

二、细胞周期检测

细胞核 DNA 含量随着细胞增殖周期时相的不同而发生变化，用 DNA 染料进行染色，DNA 含量多，荧光信号强，DNA 含量少，荧光强度低。通过对细胞瞬间的快速测定，判断细胞所处的细胞周期时相，并分析群体细胞中处于不同周期时相的细胞比例，以研究细胞的周期，DNA 复制和染色体倍性等。在肿瘤学研究中尤其常用，可以此来判断药物对肿瘤细胞影响、肿瘤的生长速度与患者预后等。

三、Th/Treg检测

通过刺激阻断剂对 T 细胞进行处理，通过检测表面或胞内标志物进行分型检测。

四、免疫分型检测

利用细胞表面或细胞内特异性抗体分子，分别选用不同标记的流式抗体对细胞进行分型和分析。

利用抗原/抗体反应原理，采用不同的流式抗体对样本进行检测可达到对不同细胞进行分型检测的目的。

五、细胞因子检测

采用 CBA 或液相芯片的方法将捕获抗体和微球/液相芯片结合，检测抗体和 SA-PE 结合通过抗原抗体特异性反应达到多种细胞因子检测的目的。

六、细胞分选

细胞分选利用流式细胞分选仪来分离纯化细胞或颗粒以供进一步分析。

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胎牛血清在细胞培养中有什么用？

        胎牛血清是一种常用的细胞培养基添加剂，可以提供细胞生长和增殖所需的营养物质、生长因子和激素等。胎牛血清由新生牛犊提取，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等。那么你知道胎牛血清在细胞培养中有什么用吗？让我们一起来看看吧！

一、作为细胞培养基组分

胎牛血清通常作为细胞培养基的添加剂，用于提供细胞生长和增殖所需的营养物质、生长因子和激素等。具体来说，胎牛血清中含有以下主要组分：

1. 蛋白质：胎牛血清是一种富含蛋白质的添加剂，其中包含多种不同种类的蛋白质，如血清白蛋白、球蛋白、免疫球蛋白等。这些蛋白质为细胞提供能量和构建细胞器和细胞结构的原料。

2. 氨基酸和肽类：胎牛血清中含有丰富的氨基酸和肽类，这些是蛋白质合成所必需的组成部分，也可以作为能量来源。

3. 生长因子和激素：胎牛血清中含有多种生长因子和激素，如胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胆固醇、甲状腺激素等。这些物质对细胞生长、增殖、分化和功能表达起着调节作用。

4. 维生素和矿物质：胎牛血清中含有多种维生素和矿物质，如维生素A、B群、C、D、E、K等以及钙、磷、铁、锰、铜、锌等。这些有助于细胞代谢和功能的正常发挥。

5. 其他成分：胎牛血清中还含有一些脂质、碳水化合物、核酸、酶和胆汁酸等成分，这些也对细胞生长和功能起到一定作用。

二、细胞培养中的作用

胎牛血清在细胞培养过程中起到了多种重要作用，包括：

1. 提供营养物质：胎牛血清中含有丰富的蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、维生素和矿物质等，提供了细胞所需的营养物质，促进细胞生长和代谢。

2. 提供生长因子和激素：胎牛血清中含有多种生长因子和激素，如胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等，这些物质能够促进细胞的增殖、分化和功能表达。

3. 维持细胞形态和结构：胎牛血清中的蛋白质和其他成分可以帮助细胞维持其形态和结构，确保细胞的正常功能和特性。

4. 抗氧化和抗凋亡作用：胎牛血清中的抗氧化物质可以帮助细胞对抗氧化应激和凋亡，提高细胞的存活率和稳定性。

5. 抗微生物感染：胎牛血清中的抗体和其他成分具有抗微生物感染的作用，可以减少细胞培养过程中的污染和感染风险。

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胎牛血清的功能与作用是什么？

胎牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，其中含有丰富的细胞生长所必须的营养成分，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。那么你知道胎牛血清的功能与作用是什么吗？让我们一起来看看吧！

一、功能

1. 提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

3. 有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

4. 是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

5. 起酸碱度缓冲液作用。

6. 提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

二、作用

1. 血清提供：营养和能量来源；生长和粘附因子；肽和类固醇激素；载体蛋白。

2. 保护细胞：免受蛋白酶、毒性物质、PH值波动、机械剪切力、氧化及自由基的损伤。

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免疫荧光实验的注意事项有什么？

免疫荧光（IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项检测技术。可用于检测和识别细胞和组织中蛋白质及其他分子的亚细胞分布和迁移。那么你知道免疫荧光实验的注意事项有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、设置对照

可以使用阳性和阴性对照来确定结果的准确性，并帮助确定任何问题的来源。

二、样品和试剂的存储

由于IF中所用抗体和实验样品的荧光性质，因此必须适当存储。最好将荧光抗体和经过IF处理的样品都保存在wan全黑暗的环境中。使用琥珀色或铝箔覆盖抗体管。

三、使用适当的固定剂

醛可用于标记膜结合抗原或细胞骨架抗原，并应用于核蛋白或线粒体蛋白。醛固定后的样本需要抗原修复和打孔渗透步骤才能正确检测抗原。如果使用单克隆抗体推荐有机溶剂用于组织固定。甲醇适用于冷冻样本的固定；丙酮固定对组织学保存效

四、仔细选择抗体

应检查所有抗体，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，以确保与目标抗原具有高的亲和力。所用的二抗必须与一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗检测小鼠来源的一抗。

五、多色染色

最好使用在不同物种中产生的一抗。如果使用间接检测，请使用已预先吸附在检测其他蛋白质的一抗和二抗的种属以及实验样品的物种中的二抗。这样可以zui大程度地减少跨物种的反应性和非特异性结合。所有二抗也应在同一物种中产生，以zui大程度地减少交叉反应。

六、决定直接或间接染色

两种方法都有优点和缺点，根据实验需求选择。使用这两种方法，都应该确保充足的洗涤以最小化非特异性的结合。

七、选择没有光谱重叠的荧光团

IF是一种很好的多路复用分析技术，测量如此多的参数，那么使用能够提供可分辨信号的荧光团是很有必要的。

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什么是文库构建？

基于NGS测序的诸多优点，故此技术在全球测序市场上占有着绝对的优势位置，而新一代测序（NGS）文库制备是一体化测序流程中的一个关键因素，那么什么是文库构建呢？让我们一起来看看吧！

基因文库是储存了某种生物的DNA片段的受体菌的集合体。文库分为储存全部DNA片段和部分DNA片段，前者叫基因组文库，后者包括cDNA文库。

文库构建的基础是将目标RNA或DNA制备成可以和测序仪器兼容的形式。从组织或者细胞中将DNA或RNA提取出来，并通过机械破碎或者是酶切法对其进行片段化。如果前面提取的是RNA样本，则需要将RNA逆转录为cDNA。对DNA进行接头的连接后，一般还会有一个文库的扩增，即通过PCR来对所需的目的片段进行扩增，然后进行上机测序。

传统的DNA文库构建包括：DNA片段化（超声法）、末端修复、加A、接头连接和PCR文库扩增等过程（Figure 1）。整个实验对DNA起始量、仪器有一定的要求。

新型的文库构建方法利用转座酶的转座原理，对DNA进行片段化并同时加上部分接头序列，是建库过程中是一个重大的进步。

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原代细胞培养的分离注意事项有什么？

分离是原代细胞培养的重要步骤之一，那么你知道原代细胞培养的分离注意事项有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、组织块培养法

1.组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2.加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。

3.当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。

4.为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。

二、贴壁型原代细胞

1.原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响，在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

2.适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

3.尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

三、悬浮型原代细胞

1.必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以5ml为zui低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

2.能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

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流式细胞术的应用有什么？

流式细胞术（FCM）是一种对处在快速流动中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。它集计算机技术、激光技术、流体力学、荧光标记技术、单克隆抗体技术、细胞免疫学于一体，按照细胞或生物颗粒的物理或化学性质，同时具有分析和分选细胞或生物颗粒的功能。那么你知道流式细胞术的应用有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、流式细胞术科研应用

1.细胞凋亡检测

在正常细胞中，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）位于胞浆侧。细胞凋亡中期，PS 外翻。Annexin V 是一种 Ca2+ 依赖的对 PS 具有高度亲和力的磷脂结合蛋白，因此可以用荧光标记的 Annexin V 检测 PS 的外翻。凋亡末期，细胞膜结构受损，原本不透膜的核酸染料（如 PI、7-AAD 等）也能进入细胞，从而产生信号。分别检测 Annexin V 和不透膜核酸染料的信号，可对凋亡中期和末期细胞的比例进行定量。

2.细胞周期检测

细胞核 DNA 含量随着细胞增殖周期时相的不同而发生变化，用 DNA 染料进行染色，DNA 含量多，荧光信号强，DNA 含量少，荧光强度低。通过对细胞瞬间的快速测定，判断细胞所处的细胞周期时相，并分析群体细胞中处于不同周期时相的细胞比例，以研究细胞的周期，DNA 复制和染色体倍性等。在肿瘤学研究中尤其常用，可以此来判断药物对肿瘤细胞影响、肿瘤的生长速度与患者预后等。

3.Th/Treg检测

通过刺激阻断剂对 T 细胞进行处理，通过检测表面或胞内标志物进行分型检测。

4.免疫分型检测

利用细胞表面或细胞内特异性抗体分子，分别选用不同标记的流式抗体对细胞进行分型和分析。

利用抗原/抗体反应原理，采用不同的流式抗体对样本进行检测可达到对不同细胞进行分型检测的目的。

5.细胞因子检测

采用 CBA 或液相芯片的方法将捕获抗体和微球/液相芯片结合，检测抗体和 SA-PE 结合通过抗原抗体特异性反应达到多种细胞因子检测的目的。

二、流式细胞术生物产业应用

流式细胞术生物产业应用主要为生物医药和医疗器械公司医药和医疗器械研发使用。

流式细胞检测离不开流式细胞仪、流式抗体和检测样本 3 部分，而其中流式细胞仪则是最重要的，它是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的高科技仪器。主要由液流系统、光学系统、电子系统、数据分析系统等组成。

自 1973 年第yi台商用流式细胞仪问世以来，经过近 50 年的发展流式细胞仪在结构上发生了一系列的演变：由简单到复杂、由单激光到多激光、由单色到多色、由分析到分选、从传统流式到质谱流式和光谱流式等。

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蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么？

在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，那么你知道蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、注意事项：

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、浓度不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3、选择合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT（二硫苏糖醇）(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液，防止微生物生长。

二、常见问题：

1、通过 His 标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？

（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

2、镍柱使用中出现棕色的原因

（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心，并过0.22或者0.45的膜。

（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入 1-2mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行加尿素变性，使其在变形环境下。

（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

3、纯化过程中蛋白出现了浑浊应如何处理？

（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

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细胞培养基的理化性质有什么？

动物细胞在细胞培养基中不仅能存活，还要分裂增殖，合适的渗透压、pH值等理化性质是细胞培养基必须具备的前提条件。那么细胞培养基的理化性质有什么呢？让我们一起来看看吧！

一、pH

动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，适宜pH在7.2～7.4之间。细胞培养基的pH值通常需经校正的pH计来测定。在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，pH值发生变化。酚红是细胞培养基中常用的pH指示剂，但依靠细胞培养基中的酚红等pH指示剂进行判断，需要实验员的经验积累，存在较大的主观性。实际上，个性化细胞培养基或是无血清细胞培养基中酚红含量较少或是不含酚红，只能通过pH计或者pH电极进行pH值的检测，结果更为准确可靠。

二、缓冲能力

 细胞培养基应具有一定的缓冲能力。细胞培养过程中造成细胞培养液 pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2。在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，细胞培养液pH 很快下降；打开培养器具时CO2逸出则会引起pH升高。细胞培养基通常采用NaHCO3-CO2缓冲系统，按下列化学反应方程式调节细胞培养基的pH值：

H2O + CO2 → H2CO3 ⇌ H+ + HCO3-

NaHCO3 ⇌ Na+ + HCO3-

三、渗透压

细胞必须生活在等渗的环境中，大多数体外培养的细胞对渗透压有一定耐受性。研究显示，对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260～320 mOsm/kg的范围内都适宜。在生产、配制细胞培养基的过程中，渗透压的测定较为重要，有助于防止在生产、配制过程中出现称量等方面的错误。反应器高密度培养动物细胞过程，在添加碳酸氢钠的过程中注意渗透压的监控，防止渗透压过高对细胞的损害。

四、温度

温度对细胞培养基有较大的影响，温度过高可引起营养成份的降解或破坏，细胞培养基的pH、离子强度和电解常数pKa也可能受到影响。如细胞培养液中的谷氨酰胺，在高温条件下降解的速度较快，如35 ℃贮存时，放置3天降解25 %左右，在4 ℃贮存3周降解约20%。

五、粘滞性及表面张力

含血清细胞培养液的粘滞性主要是由血清引起的，在转瓶培养贴壁细胞时，培养液的粘滞性对细胞生长没有多大影响；但在生物反应器悬浮培养细胞时，细胞培养液的粘滞性则直接影响搅拌转速控制及搅拌剪切力对细胞造成的损伤程度。

表面张力对细胞培养有较大的作用，尤其在利用生物反应器进行悬浮培养时，搅拌和通气都会引起泡沫的产生。对于含血清培养液，由于血清中多种蛋白的存在，搅拌时产生的气泡较多，气泡的上升运动对细胞的损伤程度还有争议，但气泡的破裂对细胞有明显的损伤作用。为降低这种损伤，可通过在细胞培养基中添加一些保护剂，降低细胞-气体和细胞-液体的表面张力，减少气泡的形成。

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