细胞瞬时转染的原理

蛋白质凝胶电泳的原理是什么？有何注意事项？

你知道蛋白质凝胶电泳的原理是什么吗？有何注意事项？让我们一起来看看吧！

一、原理

将蛋白质样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS)以及硫基乙醇一起加热，使蛋白质变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链考疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线性关系。

二、注意事项

1. 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；剥胶时凝胶板易断裂，为防止引现象，所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。

2. 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。

3. 在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

4. 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或过低无可影响电泳效果。

5. SDS纯度：在SDS-PAGE中，需高纯度的SDS,市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20g SDS放在圆底烧瓶中，加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min,用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至-20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。

6. 用SDS处理蛋白质样品时，每次都会在沸水溶中保温3——5min,以免有亚稳聚合物存在。

7. 对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15μl为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。

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你知道细胞冻存的原理和实验步骤吗？

细胞低温冻存是培养室常用技术。那么你知道细胞冻存的原理和实验步骤吗？让我们一起来看看吧！

原理：

将细胞放在-196℃液氮中，可以使细胞暂时脱离生长状态，减少细胞代谢，理论上储存时间几乎是无限的。最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。上述要求可通过下列方法获得：

1.缓慢冷冻，使细胞内水分离开细胞，但不可太慢，以避免冰晶形成；

2.用亲水的低温保护剂排除水分；

3.在尽可能低的温度下保存细胞，降低高浓度盐对冰中蛋白质变性的影响；

4.快速复苏，减少细胞内晶体形成，以及细胞内残余的冰溶解时可溶性成分的产生。

实验步骤：

1.选择无支原体污染且对数生长期的细胞，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液；

2.按常规方法将培养的细胞进行胰酶消化，然后 1000rpm 离心 5 分钟，去上清并收集细胞。然后加入已经配置好的冻存液，常用的冻存液是DMSO +wan全细胞生长培养液(20%血清+基础培养液)，吸管轻轻吹打，重悬细胞。计数，调整至5×106/ml左右；

3.将细胞悬液分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液，旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记；

4.冻存：在液氮容器中，对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的，通常的操作是把细胞先在-20℃放1-2个小时，再放入 -80℃冰箱过夜，再转入液氮罐，注意下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。推荐使用程序降温盒，操作方便，冻存效果更好。

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细胞转染常见方法之原理、特点及实验步骤

随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，细胞转染已经成为研究真核细胞基因功能的常规工具。常用于研究基因功能、基因表达调控、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用非常广泛。

目前实验室最为常用的细胞转染方法有两种：脂质体转染法和电穿孔法，接下去分别介绍这两种方法的原理、特点和实验步骤。

一、脂质体转染法

1. 原理

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞（见下图）。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最fang便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。

2. 特点

脂质体转染法的优点是能够高效转染许多细胞系，适用于高通量筛选，并能够递送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外，该方法既可应用于稳定表达，也可应用于瞬时表达，与其他化学方法不同的是，其可用于将 DNA 和 RNA 向动物和人体内转移；缺点是转染效率依赖于细胞类型和培养条件，因此，需要对每种细胞类型的转染条件和转染试剂进行优化。

3. 实验步骤

将DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和转染试剂分别在不同的管中稀释→将两者混合形成混合物→将形成的混合物加入细胞中，脂质体的正电荷有助于帮助复合物粘附到细胞膜上→复合物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。

二、电穿孔法

1. 原理

利用电脉冲可逆地击穿细胞膜形成瞬时的膜上小孔，同时细胞膜上电势升高，驱使带电荷的分子（如 DNA）以类似于电泳的方式经临时微孔穿过细胞膜进入胞内（见下图）。当遇到某些脂质体转染效率很低或几乎无法转入时建议用电穿孔法转染。一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。为确保转染成功，针对实验条件优化电转参数是极为重要的。电场强度、脉冲形状、脉冲施加次数、缓冲液组分等因素都会影响转染效率。

2. 特点

与其他转染方法相比，电转染具有诸多优势，其中主要优势包括：适用于所有细胞类型的瞬时和稳定转染；在确定最佳电转染条件的情况下，能够在短时间内转染大量细胞。电转的主要缺点在于高电压脉冲可引起大量细胞死亡，仅部分细胞膜可以成功修复，因此相比化学转染方法，电转染需要使用更多数量的细胞。

3. 实验步骤

利用电转缓冲液重悬细胞→对含有核酸，缓冲液，细胞的混合物给予合适的电脉冲→电脉冲在细胞膜上形成电势差，诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞→将细胞返回到生长培养基中，使其慢慢恢复→检测基因表达或沉默情况。

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原子力显微镜的原理