重组蛋白的研发趋势

重组蛋白的迅速开展有着必然性，但要持续开展，有几个问题必须解决或优化，包括生产载体与产量、基因工程改造和翻译后修饰以及用药途径。
1、生产载体与产量
生产力不足是重组蛋白研发的瓶颈。以HIV蛋白微球〔microbicides〕为例，虽然能防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产量不够。还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家也难以使用，主要是生产能力缺乏，而且价格昂贵。
哺乳动物细胞和大肠杆菌〔E.coli〕是上市重组药物最主要的生产载体。E.coli用于表达不需要翻译后修饰的重组药物，如胰岛素、生长激素、β干扰素和白细胞介素等。CHO细胞是最为常用的生产载体之一，其糖基化最近似人的糖基化结构，但糖基化产物是不均一的混合物。BHK细胞是第二常用的，另外，NSO、HEK-293和人视网膜细胞表达的蛋白也获得过批准。目前，哺乳动物细胞的产量亟待提高。另一个正在取得突破的是植物表达体系〔molecular farming〕，植物糖基化免疫原性低，不易诱发过敏，但有可能改变一些糖蛋白的功能。

2、重组药物的基因工程改造和翻译后修饰
高度纯化的重组蛋白与人内源蛋白相同或高度相似，能防止出现免疫反响。但有30%左右重组药物是经过基因工程改变或经过其他手段进行翻译后修饰的，也有文献指出现有上市重组蛋白药物种基因改造率达38%。改变蛋白的结构的目的是为了优化其药代动力学，但又不能弱化其生物功能及产生新的抗原性。
3、用药途径的变革
绝大多数重组药物是注射给药或静脉途径，仅有2个是喷雾剂。有些疾病如糖尿病、肾衰性贫血等都需要长期使用药物，注射或静脉途径的方式非常不便利，从而人们在给药途径上进行了大量的尝试。

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人大血管内皮细胞培养基

人大血管内皮细胞培养基

When supplemented with low serum growth supplement (LSGS), this medium supports the plating and proliferation of endothelial cells at culture densities between 2.5 x 103 cells/cm2 and 1 x 105 cells/cm2. Additional applications may include primary isolation of endothelial cells. This medium is also available without phenol red (Cat. No. M200PRF500).

Human Large Vessel Endothelial Cell Basal Medium is a basal culture medium containing essential and non-essential amino acids, vitamins, other organic compounds, trace minerals, and inorganic salts. This medium does not contain antibiotics, antimycotics, hormones, growth factors, or proteins. It is HEPES and bicarbonate buffered and designed for use in an incubator with an atmosphere of 5% CO2/95% air. To support the plating and proliferation of human large vessel endothelial cells, this medium must be supplemented with LSGS (Cat. No. S-003-10; kit = Cat. No. S-003-K).

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美国源间充质干细胞胎牛血清

美国源间充质干细胞胎牛血清

Product Name:Fetal Bovine Serum (FBS), US Origin, Qualified for Mesenchymal Stem Cells.美国源间充质干细胞胎牛血清

Product description: Product DescriptionEach lot of MSC-qualified FBS, US Origin (04-400-1A-US) is screened by growing human mesenchymal stem cells (hMSCs) over a minimum of three subculture generations with 10 percent serum. Human MSC’s are evaluated on cell count, expansion and morphology. MSC’s are phenotypically assayed by flow cytometry. FBS is tested in parallel with a control lot which has been demonstrated to support the growth of hMSC.- US origin FBS- Triple 0.1 µm Filtered- Endotoxin: ≤ 10 EU/mL; Hemoglobin ≤ 25 mg/dL.

Isotype: Cocktail.

Host Species: Alligator.

Purification: Affinity purified.

各种转染试剂的中文说明

各种转染试剂中文说明

一、PEI Prime Powder, Transfection Grade Linear Polyethylenimine(Serochem)转染步骤（以 HEK293 贴壁细胞为例）

1.细胞接种：细胞密度 2-6 x106 cells/mL.

2.质粒的准备：在 5％最终培养体积的 DMEM 或培养基中，每 10 6 个细胞稀释1.0 ug pDNA。

3. PEI 的准备：在 5％最终培养体积的 DMEM 或培养基中，每 10 6 个细胞稀释3.0 ug PEI Prime，混匀通过快速，短暂涡旋或颠倒数次试管，将 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。

4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室温下静置 10 分钟。一边旋转板，一边将 pDNA 和 PEI 混合物逐渐滴加到细胞中。

5.于 37℃ CO₂ 培养箱中培养。

二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤：

说明：以下步骤适用于在 6 孔培养板中转染贴壁细胞。开始时，每 6 孔培养板使用 0.4ug DNA。尽管 DNA 的量看起来很少，但已足够用于转染。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。

转染前一天，用 5ml 含血清和抗生素的培养基分装使每 6 孔培养板含 2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。在细胞的正常培养条件下培养（通常 37℃和 5％CO2）。转染当天细胞应 40–80％融合。转染时，用 DNA 浓缩缓冲液（EC Buffer）稀释 1ug DNA 至 100ul 总体积（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 浓度：0.1ug/ul）。加入 3.2ul Enhancer， 涡旋 1s 以混合溶液。

重要：请保持 DNA 与 Enhancer 比例恒定。

 注意：质粒 DNA 的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的 DNA。室温（15-25℃）孵育 2-5 分钟，离心（spin down）几秒钟以从管顶去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent，反复吸取 5

次或涡旋 10 秒钟以混合。

注意：没必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室温中放置 10-15 分钟不会改变它的稳定性。

室温下（15-25℃）孵育 5-10 分钟以形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用 4ml PBS 洗涤一次细胞。加入1.6ml 新鲜培养液（可以包含血清和抗生素）到细胞中。加入 0.6ml 培养液（可以包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的 EP 管中。吸取两次以混合，立即将转染复合物 drop-wise 加入 6 孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育适当的时间直至转染基因表达。孵育时间和由所采用的实验和所使用的基因决定。

Optional: 大多数情况下，不需去除转染复合物。然而，如果观察到细胞毒性，则需在转染后 6-18 小时移除 Effectene-DNA 混合物，用 PBS 洗涤一次细胞， 然后加入 5ml 新鲜细胞培养液。

瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。

转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育 24-48 小时以使转染基因的表达。

稳定转染时，在转染后 24-48 小时，将细胞以 1:5~1:10 传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。

注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量–反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。

以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育 1-2 天，然后再加入选择性培养液。

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254培养基

254培养基

When supplemented with HMGS or HMGS-2, Medium 254 will support the plating and proliferation of melanocytes at varying culture densities from 5 x 103 cells/cm2 to 1 x 105 cells/cm2. Additional applications for use may include primary isolation of melanocytes from skin.

Medium 254 is a basal medium containing essential and non-essential amino acids, vitamins, other organic compounds, trace minerals, and inorganic salts. This medium does not contain antibiotics, antimycotics, hormones, growth factors, or proteins. This medium is HEPES and bicarbonate buffered and designed for use in an incubator with an atmosphere of 5% CO2/95% air. To support plating and long-term proliferation of normal human melanocytes, Medium 254 must be supplemented with Human Melanocyte Growth Supplement (HMGS) or PMA-Free Human Melanocyte Growth Supplement-2 (HMGS-2). Each of these supplements contains all of the growth factors, hormones, and tissue extracts necessary for growth of melanocytes in Medium 254.