细胞转染：瞬时转染和稳定转染及转染效率影响因素

真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。

在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。

瞬时转染

瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。

稳定转染

稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经*整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。

瞬转稳转适用性

瞬时转染表达和稳定转染表达显著的区别就是在时间上。瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。

细胞转染一般步骤

以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染

1）转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。

2）针对每孔细胞，用50-100ul无血清培养基稀释0.8-1.6ug的质粒，并混匀

3）针对每孔细胞，用50-100ul无血清培养基稀释4ul左右的转染试剂，混匀室温防止5min

4）将第二第三步的溶液混匀室温防止20-30min

5）用PBS冲洗细胞，在用无血清培养基冲洗细胞，在加入0.5ml的无血清培养基

6）将四步骤得到的混合物加入到每孔中，轻摇混匀后放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养5-6h

7）将无血清培养基换为血清培养基（10%胎牛血清）孵育24-96h后检测结果。稳定表达，在转染24h后传代新鲜培养液中，48h后加入抗性，稳定表达需要数周时间。

哺乳动物细胞瞬时转染流程图

影响转染效率因素

1. 转染试剂

瞬时转染和稳定转染可以选择不同的转染试剂，转染试剂的选择又可以根据已经发表的文献。已经有很多细胞株被成功转染，通过文献资料可以参考适的转染试剂，当然也要根据不同的实验需求选择。此外，不同的转染方法也要选择不同的试剂，一般要求是转染试剂要低毒，高效，廉价易得。

2. 转染方法

转染方法分为两类：瞬时转染和稳定转染。转染方法的选择对转染结果影响也很大，。根据细胞的性质及不同的操作手法，摸索转染条件。瞬时转染和稳定转染都需要优化DNA 与转染试剂比例， 细胞培养及检测时间。一些传统的转染技术，如磷酸钙法，电穿孔法，脂质体转染法都各有利弊，关于各种转染方法的比较和原理，可参见细胞培养方法的比较。

3. 细胞状态

一般传代数小于50代以下的细胞即能保证基因型不变。瞬时转染合适的细胞是达到对数生长期的细胞，此时细胞生长旺盛，容易被转染。同一种系的细胞株，在不同实验室不同培养条件下，其生物学性状都会产生不同改变，从而导致其转染特性也发生变化。因此，针对这种转染效率降低的情况，应转用新鲜培养的细胞转染达到好的结果。

4. 载体构建

基因产物对细胞不能有毒害作用，瞬时转染难以进行。转染载体的构建选择可调控，强度合适的启动子很重要，可以做空载体或相同载体的其他基因为对照排除毒性对细胞的影响。 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞。

5. 其他要求

（1）细胞培养基

培养基是瞬时转染的基本要素。不同细胞选择不同的培养基，血清和其他添加物。使用的转染试剂要参考其说明书。培养物一定要避免细菌，支原体真菌的污染。

（2）血清

血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的成分不明确添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响细胞转染效率，不同批次购买的血清质量也会存在差别。对于传统的转染方法要求在无血清培养基条件下转染，血清被认为会降低瞬时转染的效率。针对现有人们常用的的转染试剂来说，血清的存在已不会影响转染效率，甚还有助于提高转染效率。在转染过程中*可以使用血清，针对RNA 转染，消除血清中潜在的核糖核酸酶污染要格外关注。且血清比较珍贵，胎牛血清，马或牛血清都常被用到，价格也不尽相同，根据自身选择。

（3）细胞密度

细胞密度对转染效率也有一定影响，一般转染时贴壁细胞密度为50-90%，具体要根据选用的转染试剂的说明书。不同的转染试剂适的细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。

例如阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而要更高的细胞铺板密度或更多的悬浮细胞数， 尽量在细胞适的生理状态下转染，以求好的转染效果。

（4）DNA 质量

针对一般常用的转染技术都是基于电荷吸引的原理转染的，如果DNA的纯度不高，存在其他杂质，如盐离子等都会影响转染复合物的形成。针对市面上现有的超纯质粒抽提的试剂盒，能达到非常高的纯度效果，从而可以避免DNA纯度的影响。

我们为什么要睡觉？

人的一生中约有三分之一的时间都在睡觉，睡眠是整个动物界生存所必须的过程。有研究表明，动物在醒着的时候会受到一定程度的神经系统损害，由此产生的受损基因和蛋白质，会在脑部堆积并引起疾病，而睡眠有助于修复这种损害并清除这些垃圾。

也有实验发现，睡眠可以促进与学习和记忆巩固相关的神经塑性重组及突触的生长。但我们目前对于神经修复和重组在睡眠期间的相对作用，以及其在个体发育过程中是否会发生变化仍不清楚。

近日，来自英国帝国理工大学、美国加利福尼亚大学以及德克萨斯大学的研究团队在《Science Advances》上发表了题为Unraveling why we sleep: Quantitative analysis reveals abrupt transition from neural reorganization to repair in early development的研究成果，揭示了个体系统发育过程中睡眠的变化，发现神经塑性重组主要发生在快速眼动睡眠（REM）中，而睡眠的主要功能会在约2岁半时发生变化，由神经重组及学习转为功能修复和垃圾清除。

DOI: 10.1126/sciadv.aba0398

研究人员利用来自60多项包括人类和其他哺乳动物的睡眠研究的数据，进行了迄今为止全面的睡眠统计分析。检查了个体从出生到成年整个发育过程中的睡眠数据，包括总睡眠时间，REM睡眠时间，大脑大小、体重，脑代谢率、身体代谢率和睡眠代谢率（SMR），以及个体发育数据，包括大脑的白质、黑质和突触密度等，并建立了*的定量理论和数学模型来分析突触密度、睡眠时间、大脑大小与脑代谢率之间的联系，解释个体发育中睡眠如何随大脑和体重变化而变化。

发育早期的不同睡眠时间比例

发育后期的不同睡眠时间比例

数据分析发现，REM睡眠会随着大脑大小的增大而减少。新生儿的睡眠时间中有50％为REM睡眠，但到10岁时其占比会下降到25％左右，且随着年龄的增长而持续减少。50岁以上的成年人的REM睡眠时间仅占15％。REM睡眠时间的减少大概是从2岁半开始发生的。而且当所有物种达到相当于人类约两岁半的年龄时，其REM睡眠时间也会开始急剧下降，无论是小鼠、兔子还是猪。

功能转化前的脑代谢及与脑质量和年龄的关系

REM睡眠占比的显著下降，也代表着睡眠功能发生着重大的变化。研究发现2岁半前的睡眠主要是进行大脑的构建、神经重组和学习，而2岁半后，睡眠的主要功能逐渐转化为大脑的维护和修复，即神经系统损害的功能修复和代谢物等垃圾的清除。且后期几乎所有的大脑修复都是在睡眠中进行的。

睡眠功能从重组到修复的转变

该研究的作者Gina Poe说，对于大多数成年人来说，每晚七个半小时的睡眠是正常且需要的，婴儿和儿童需要更多甚于两倍的睡眠。长期缺乏睡眠可能会导致产生痴呆症、糖尿病和肥胖症等健康问题，而睡个好觉，是免费的良药。

参考资料：

Unraveling why we sleep: Quantitative analysis reveals abrupt transition from neural reorganization to repair in early development