如何解决病毒转染实验的常见问题？

病毒转染是指将外源病毒导入真核细胞的技术，用病毒将带有目的基因的载体整合到细胞的基因组中，以达到长期稳定表达目的基因的目的，那么你知道该如何解决病毒转染实验的常见问题吗？让我们一起来看看吧！

一、转染效率低

可能是由于病毒感染的细胞数量不足、浓度太低、转染时间过短、细胞质量差等原因导致。可以尝试增加病毒的浓度和转染时间，或者优化细胞培养条件来提高转染效率。

解决方法：优化病毒载体和转染剂的选择和使用方法，调整细胞的培养条件和密度，增加转染时间和浓度等操作方案。

二、细胞毒性

病毒转染过程中产生的细胞毒性会直接影响细胞的生长和稳定性，甚至影响实验结果。需要注意选择合适的病毒载体和转染剂，并对细胞状态和密度进行调整。

解决方法：针对病毒转染产生的细胞毒性，可采用补充营养物质、调节培养基pH值或温度、添加保护剂等方式进行缓解。

三、重复感染

在进行病毒转染时，避免病毒的重复感染，可对细胞进行预处理和检测，尤其是对病毒拓展因子表达的细胞系进行特别注意。

解决方法：加强实验前的准备工作，避免重复感染的发生。例如，对细胞进行必要的预处理和检测，及时更换新鲜培养基，使用消毒材料等。

四、非特异性效应

外源DNA或RNA转染后，可能会影响宿主基因表达和细胞功能，出现非特异性效应。需要对目标基因进行严格的鉴定和筛选，以确保实验结果的准确性和可靠性。

解决方法：通过对外源DNA或RNA转染后基因表达的分析鉴定，筛选出特异性效应较好的目标基因，并进行进一步的实验验证和数据分析。

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病毒载体在亲和层析填料上的新选择

亲和层析填料是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术，常用于从复杂性高、难度大的进料流中捕获目标产物,是纯化病毒载体的理性型。但是，病毒载体纯化对亲和层析填料的要求也非常高，主要是由于病毒载体的滴度低、杂质水平高、敏感性强、粒径可变性大，这都给选择哪种亲和层析填料带来了不小的难度，包括层析基质（填料/整体柱/膜/纤维）和配基的选择难度也不小。

一、病毒载体纯化在亲和层析填料选择上的“拦路虎”

1.病毒载体的敏感性性强

在强酸、强碱、高盐、低盐、高剪切等环境条件下，病毒载体高度敏感，这对亲和层析填料的配基的选择带来了难度。亲和层析填料的配基跟目标病毒载体良好结合后，在相对温和的洗脱条件下，才可能避免在纯化过程中病毒颗粒由于PH的变化所导致的感染性丧失的问题。

2. 病毒载体的粒径可变性大

病毒载体的类型不同，大小也不相同，一般大小在20 到 200 nm的范围内，有些病毒载体可能更大，如溶瘤病毒。病毒载体的粒径越大，亲和层析填料的动态结合载量 (DBC)越小，所以需要更大的柱-亲和层析系统来进行纯化，这势必会增加成本。

3. 病毒清洗和消毒的问题

病毒载体的敏感性、粒径的可变性，在去除生物负荷这个问题上，也会产生不小的难度，因为一些用作亲和层析填料的配基是蛋白质或者肽，它们与在线灭菌 (SIP) 方案可能存在不兼容的地方。因此，病毒清洗和消毒对配基的选择上的重要性不言而喻。

二、病毒载体的亲和层析填料的商业化情况

1. 病毒载体的亲和层析填料商业化的挑战

病毒载体的亲和层析填料商业化具有两大挑战：一、目标较大的产物可能会产生较低的产能。因为，目前的亲和填料通常是为抗体的最佳工艺而设计的,粒径大多在 10-15 nm左右，但是许多病毒载体的粒径较大，如腺病毒为90-100nm、 γ – 逆转录病毒为80-100nm，根本无法进入孔内与基球进行结合，导致产能降低。二、亲和层析填料通常必须特定于某种病毒载体，对于 AAV ，还必须是特定的血清型（AAV2、AAV8、AAV9 等）。这就意味着这一类别的填料的应用困难，病毒载体生产商很难使用单一亲和层析填料为一系列载体构建平台纯化工艺。

2. AAV亲和层析填料商业化情况

目前，市面上的AAV亲和层析填料的类型主要有： 血清特异型和非特异型。对于血清特异型，都需要进行优化和筛选，从而找到对血清特异型能很好地与亲和配基结合的填料。

但是病毒载体的情况越来越复杂，就会存在与现有的亲和配基不结合的情况。因此，亲和层析填料的生厂商把眼光又转移到了基于电荷的平台化方法上来，这种方法能降低成本、兼容SIP和CIP工艺、跨血清型灵活。

三、AAV亲和层析填料的新方案

英国Biotoolimics推出了针对AAV的亲和层析填料：ViralPolish^TM 5000B，该产品包含双层琼脂糖珠（含惰性外壳），孔径大小受到严格控制，内部多功能配体可快速高容量结合杂质。ViralPolish^TM 5000B亲和层析填料专门为温和洗脱条件下，AAV而设计，在不牺牲动态结合载量的情况下提高碱稳定性。

慢病毒包装

慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一， 并且正在获得越来越广泛的应用。

      在细胞实验中，对于按常规方法难以转染甚无法转染的细胞，通过使用病毒介导的方式能够大大提高基因的转导效率，达到目的基因高效表达的目的。

       具体来说，慢病毒包装主要应用于以下几个方面：

       1、对于难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，极大地方便了RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究；

       2、进行稳转细胞株的筛选；

       3、为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；

       为产生高滴度的病毒颗粒，通常需要利用慢病毒表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。离心收集上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。

       慢病毒包装实验方法

        1.构建含有目的基因的慢病毒表达载体

        2.细胞准备：细胞传代后，密度达到70％左右时进行转染；

        3.转染复合物制备：取两个EP管，一个（A管）加入慢病毒载体的表达质粒、混合包装质粒和Opti-MEMI；另一个（B管）加入Opti-MEMI、转染试剂，一边轻柔涡旋A管，一边往A管滴加B管的溶液。溶液混合后，室温放置10-25分钟，即完成转染复合物的制备。

        4.细胞转染：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；

        5.收集病毒：转染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

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病毒载体构建/慢病毒包装

技术简介
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷Ⅰ型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，属于逆转录病毒科，慢病毒属，基因结构复杂，共包含9个基因，其中有3个和单纯逆转录病毒相似结构的基因：gag、pol、env；4个辅助基因：vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因：tat和rev。该病毒能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，可作为一种体外运输工具，从而大大增加了转染率，同时具有感染分裂期和非分裂期细胞、容纳外源性基因片段，可以稳定表达，持续时间长等显著优点。非常适用于基因过表达稳定细胞株的建立和RNA研究。
慢病毒包装系统一般由慢病毒表达和慢病毒包装载体组成，慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。构建原理是将HIV2基因组中的顺式作用元件（包装信号和、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
 

慢病毒包装实验流程

技术应用

应用于稳转细胞株的筛选
为活体动物模型试验提供高质量的包含目的基因的病毒液
对于一些难转染的细胞，大大提高目的基因的转导效率

客户提供
客户与我司沟通商讨的试验方案
靶基因信息，模板或测序报告，
是否自行构建病毒载体，若需要本贵公司提供载体，需要额外收取费用

质量控制
测序鉴定
根据特定引物作RT-PCR鉴定
蛋白表达鉴定（根据客户需求，客户提供单克隆抗体）

实验周期
20~30个工作日

我们的优势
1、提供各种实验材料和仪器，满足项目课题实验需要。
2、专业的操作人员。
3、高规格实验室。
4、数据结果交付周期快。
5、完善的服务体系，全程跟进，确保满意。

服务流程
1、提交项目课题相关需求和资料。
2、与我们的专业技术团队讨论项目细节。
3、根据讨论后的意见对实验方案进行修改。 
4、双方均满意并达成一致，签订技术服务合同。
5、开展实验，按期完成合同规定的内容。
6、结题，提供实验原始结果和分析结果、实验流程、实验条件等等。

咨询与订购 
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