新型交联剂琥珀酰亚胺酯双吖丙啶/N-羟基琥珀酰亚胺酯双吖丙啶NHS–ester diazirine)SDA/LC-SDA /SDAD 衍生物

琥珀酰亚胺酯双吖丙啶（succinimidyl ester diazirine,SDA）试剂是一类新型的交联剂，其可将已被证实的氨基反应化学与创新且高效的基于双吖丙啶的光化学结合，用于将含有氨基的分子交联到几乎所有其他功能基团上。SDA交联剂包括六种化合物，它们具有不同的间隔臂长度，不同的剪切交联蛋白的能力以及不同的膜通透性（有或无带电基团）。蛋白交联是用于研究蛋白结构以及稳定蛋白–蛋白相互作用的重要技术。

在捕获蛋白相互作用时，双功能性氨基或巯基反应交联剂需要两种蛋白上的特定氨基酸基团（例如，赖氨酸或半胱氨酸）具有适当的间距。SDA交联剂通过使用氨基反应活性的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS ester）对一种蛋白进行特定标记，然后使用紫外线活化将双吖丙啶交联于第二种蛋白的任意氨基酸侧链或肽段骨架上，从而避开了这一限制。基于双吖丙啶的光交联剂较基于苯基叠氮化物的光交联剂具有更好的光稳定性，并且易于被长波紫外光（330-370nm）活化。

N-羟基琥珀酰亚胺酯双吖丙啶(NHS–ester diazirine) 衍生物（SDA，LC-SDA 和SDAD ）缺少带电基团，因此具有膜通透性。此特性使其适于用于细胞内和膜内交联。相反，Sulfo–SDA，Sulfo–LC–SDA 和Sulfo–SDAD 含有带负电荷的硫酸根基团，改善了其水溶性并降低了其膜通透性，因此可将其用于细胞外蛋白的交联。SDAD 和Sulfo–SDAD 的间隔臂中还含有一个二硫键，可被还原剂剪切。

使用NHS–Diazirine进行细胞内和细胞外蛋白的光反应性交联为了证明使用SDA试剂将细胞内蛋白复合体进行光反应性交联，我们检测了HeLa细胞中有关早期内吞体抗原1(early endosome haitigen, EEA1）蛋白的蛋白相互作用。EEA1通过卷曲螺旋结构域(coiled coil domain) 形成同源二聚体，结合到磷脂囊泡上, 参与内吞体的运输。细胞用各种NHS-Diazirine衍生物孵育并用紫外光处理。然后将细胞裂解并进行SDS–PAGE分析，使用抗EEA1抗体进行Western blotting 分析。暴露于紫外线后，EEA1迁移率降低的形式仅在SDA和SDAD处理的样品中检测到，而在模拟处理对照样品中未检测到（如图）。

NHS-ester diazirine 交联机制。在pH 值为7-9 的缓冲液中，NHS ester 与伯胺基团（-NH2）有效反应形成稳定的酰胺键并释放NHS。使用长波紫外光（330-370）光活化双吖丙啶形成有活性的碳烯中间体。这样的中间体通过进一步反应与对应间隔臂长度距离上的任意氨基酸侧链或肽段骨架形成共价键。

由于EEA1是细胞内蛋白复合体，它不会被不透细胞膜的Sulfo–SDA交联。此外，具有更低迁移率的、SDAD–交联的EEA1可被还原剂二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）在间隔臂内剪切。为了说明细胞膜蛋白交联，我们对比了使用可逆的磺化的N–羟基琥珀酰亚胺–双吖丙啶（Sulfo–SDAD），磺化的苯基叠氮化物交联剂（sulfonated phenyl azide, Sulfo–SANPAH）或同源双功能N–羟基硫代琥珀酰亚胺酯（BS3）处理细胞后异二聚体钠/钾（Na/K）ATPase 的交联情况。样品使用BCA蛋白定量法标准化蛋白含量，并且使用抗GAPDH的抗体检测以表明等量上样。暴露于紫外线后，通过Western Blotting观察，使用Sulfo–SDAD处理的样品比使用Sulfo–SANPAH或BS3处理的样品明显具有更多的细胞表面Na/Kβ链交联产物。

NHS-Ester Diazirine（SDA）交联剂在细胞内交联EEA1 蛋白复合体。HeLa 细胞（2×106） 在PBS 中用1mM 的SDA，Sulfo-SDA，LC-SDA 或SDAD 标记10 分钟。未反应的NHS ester 用终浓度100mM，pH8.0 的Tris•HCl 淬灭5 分钟，然后用PBS 洗涤。NHS-diazirine 标记的细胞和模拟处理对照在PBS 中使用Stratalinker2400 在365nm 处紫外线照射15 分钟，距离为4cm。紫外线处理后，裂解细胞提取蛋白，使用BCA 蛋白定量试剂盒分析总蛋白浓度。除了一个重复的SDAD处理样品（-DTT）之外，每个样品取10μg 加入还原性样品缓冲液，用SDS-PAGE 进行分离。结果使用抗EEA1 抗体通过Western blot 进行分析。

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