细胞污染问题分析与解决

细胞污染问题分析解决

细胞转染时，细胞状态的好坏对转染效率有很大影响。细胞污染可能会导致细胞死亡，本文主要总结了细胞培养中常见污染现象和解决方法。

凡是对细胞生长有危害的成分或者造成细胞不纯的异物都视为污染。细胞污染根据污染源可以分为化学污染，物理污染和生物污染。本文主要描述微生物污染的现象及解决方法

微生物污染

1. 细菌：细菌污染常见的有大肠杆菌，葡萄球菌等。细菌污染较易发现，在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，培养液一般会在短时间内变黄，有时静置的培养液不混，稍加震荡，变会有很多混浊物漂起。显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。

处理：① 在培养液中加入相应的抗生素，能够预防绝大多数的细菌污染

②保证器皿、水充分灭菌，空气无菌，同时保证灭菌压力。
2、霉菌：霉菌的污染多数是白色念珠菌， 曲霉菌，酵母菌等。霉菌污染后培养液短期内依旧清亮不变浑浊，倒置显微镜下可看见细胞之间有交错的丝状，树枝状菌丝，漂浮在培养液中。念珠菌呈卵圆状，在细胞周边生长。细胞被霉菌污染后，仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。

处理：先确定污染物的种类：细菌、真菌还是支原体。如果是霉菌污染。迅速将污染细胞与正常细胞系隔离，并对实验中所用过的所有器皿工具消毒

3、支原体：支原体的大小介于细菌和病毒之间，是一种独立生活的微生物。对热敏感，对一般抗生素不敏感。支原体的形态多变，多吸附在细胞表面和细胞之间。电镜下观察，中心有高密度的密集颗粒，横断面与细胞微绒毛相似。

因国内的血清很多数都没有做支原体阴性检测，而支原体又是牛血清中常见的微生物之一。支原体污染细胞后，培养液轻微发生混浊．但细胞变化不显著，在细胞逐渐的培养中，细胞会慢慢死亡。

支原体污染检测：

荧光染色法：DNA和与DNA特异性结合的荧光染料结合，使得支原体的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

解决：① 抗生素排除法：支原体污染预防比解决好。如果不小心污染后，可加入高浓度抗生素（常规使用的5倍浓度）作用24-48小时，再换入常规培养液，但该法不保证有效。推荐用量：庆大霉素 200ug/ml ,四环素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。

2 加温除菌：支原体不耐热，可以对支原体污染的细胞热处理除菌。将支原体污染的细胞放置41度中作用10小时可杀死支原体。因高温对细胞本身也会产生一定影响，故热处理前需行预实验，确定对细胞影响小而能大程度的杀死支原体的时间。
4、黑蛟虫：黑胶虫污染后细胞中出现小黑点，高倍镜下可看见不规则的运动。培养液浑浊不明显，对细胞生长状态无太大影响。

解决：如果细胞出现黑胶虫污染，可增加细胞的接种密度，提高细胞存活率。当细胞生长状态很好时，黑胶虫的数量会降低。细胞培养过程中坚持要每天换液，并用缓冲液冲洗，能够大大降低黑胶虫的数量，可终消失，偶尔在镜下可见个别小黑点，但整体细胞培养和后续的细胞转染无影响。

细胞培养箱染菌清洗方法

用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右）。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，制霉菌素或放线菌素D或双抗都无法弥补，舍弃被污染细胞，并将环境*消毒。如果所有细胞都污染，可能是整体系统污染，检查所有培养基和器材，并重新灭菌。针对个别污染，先考虑操作问题，注意操作规范。

药物代谢动力学分析技术服务

药物代谢动力学分析简介
1.了解药物的吸收、分布、生物转化、排泄的基本概念及影响因素。掌握关消除概念及细胞膜两侧pH对药物吸收和分布的影响。
2．熟悉药物消除动力学、时量曲线及多次给药的血药浓度变化
3．掌握药代动力学基本参数的药理学意义。了解房室模型及意义。
药物的吸收和影响因素
药物的吸收(absorption)
吸收是指药物从用药部位进入血循环的过程。口服药物吸收后经门静脉进入肝脏，有些药物进入肝脏就被肝药酶代谢，进入体循环的药量减少，称为关消除(first pass elimination)。经过肝脏关消除过程后，进入体循环的药量与实际给药量的相对量和速度，称生物利用度。药物的吸收分布及排泄过程中的跨膜转运有多种形式，但多数药物是以简单扩散的物理机制转运，扩散速度除取决于膜的性质、面积及膜两侧的浓度梯度外，还与药物的性质有关。分子小、脂溶性大、极性小、非解离型的药物易通过生物膜。药物的解离度也因其pKa（酸**物解离常数的负对数）及所在溶液的pH不同而不同。非解离型（分子态）药物可以自由通过生物膜，离子型（解离型）药物不易通过生物膜。多数药物为弱酸性或弱碱**物。弱酸**物在酸性环境中解离少，分子态多，易通过生物膜；弱碱**物则相反。由于膜两侧pH不同，当分布达平衡时膜两侧的药量会有相当大的差异。
药物的分布和影响因素
药物的分布(distribution )
指药物从血循环系统到达组织器官的过程。影响分布的因素 ① 药物本身的物理化学性质（包括分子大小、脂溶性、pKa等）。② 药物与血浆蛋白结合率：结合药不能通过生物膜，只有游离药物才能向组织分布。③ 组织器官的屏障作用，如血脑屏障、胎盘屏障。④ 细胞膜两侧体液的pH。如细胞内液pH（约为7.0）略低于细胞外液（约7.4）、弱碱**在细胞内浓度略高，弱酸**在细胞外液浓度略高，根据这一原理，弱酸******中毒时，用碳酸氢钠碱化血液和尿液可使脑组织中药物向血浆转移，并减少肾小管的重吸收加速自尿排泄。
药物的代谢
药物的生物转化(biotransformation) 又称代谢，是指药物在体内多种药物代谢酶（尤其肝药酶）作用下，化学结构发生改变的过程。肝脏微粒体的细胞色素P-450酶系统，是肝内促进药物代谢的主要酶系统，简称肝药酶。肝药酶具有活性有限、个体差异大、易受药物的诱导和抑制的特点。某些药物能增加肝药酶的活性，增加药物的生物转化，称肝药酶诱导剂，反之则称肝药酶的抑制剂。
药物的排泄
药物的排泄(excretion)  排泄是药物从体内排出体外的过程。肾脏是药物排泄的主要器官。原形经肾脏排泄的药物在肾小管可被重吸收，使药物作用时间延长。重吸收程度受尿液pH影响，应用酸性药或碱**，改变尿液的pH，可减少肾小管对药物的重吸收。
有些药物如洋地黄毒甙，部分在肝细胞与葡萄糖醛酸结合后，随胆汁排入小肠，在小肠水解后游离药物又被吸收，称肝肠循环(hepato-enteral circulation)。洋地黄毒甙中毒时，可服用消胆胺，消胆胺可与洋地黄毒甙在肠道结合，结合物随粪便排泄，打断肝肠循环。乳汁pH略低于血浆，碱**物部分可自乳汁排泄。从乳汁排泄量较多的药物应注意对乳儿的影响。

咨询与订购
感谢您选择我们的服务，如果您有任何问题，请联系我们，我们将竭诚为您解答和服务。

同工酶活性分析服务

同工酶分析介绍
同工酶(isoenzyme)是指蛋白的分子结构、理化性质乃免疫学性质不同，但是催化的化学反应相同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚是不同的细胞中。同工酶的产生是由于生物进化过程中对代谢过程的适应。越是关键的代谢调控酶或与外界环境密切相关的酶，同工酶也越普遍，同时分子类型也越多。通过同工酶谱的分析，我们可以研究物种进化、遗传变异、杂交育种、个体发育差异等多种信息。

 
检测内容
利用电泳分析法解析乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、酯酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶等一系列同工酶谱，并依据电泳迁移率差异绘制同工酶谱。

同工酶谱检测分析服务
酶谱法的基本过程是先将样品进行聚丙烯酰胺电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，后用对应的染料将凝胶染色、脱色，条带的强弱与酶活性成正比。

服务流程
1、提交项目课题相关需求和资料。
2、与我们的专业技术团队讨论项目细节。
3、根据讨论后的意见对实验方案进行修改。 
4、双方均满意并达成一致，签订技术服务合同。
5、开展实验，按期完成合同规定的内容。
6、结题，提供实验原始结果和分析结果、实验流程、实验条件等等。

检测结果示例
LDH同工酶电泳图谱
 

客户注意事项
1、为保证酶谱数据的可靠性，建议提供新鲜的组织样品，或者液氮速冻经干冰保存邮寄。
2、样品数量不足10个时，按照10个样品收费，样品数量多享受更大优惠。
3、整版胶的实验结果达不到鉴定分析标准，则认为实验操作失误，全部不收费；如果整版胶结果正常，极个别泳道结果异常，则说明为样品本身原因造成，全部样品正常收费。
4、同工酶种类繁多，而且同工酶检测方法和检测指标差异较大，因此不同的酶谱价格和检测周期需要进行预实验后才能确定。

我们的优势
1、提供各种实验材料和仪器，满足项目课题实验需要。
2、专业的操作人员。
3、高规格实验室。
4、数据结果交付周期快。
5、完善的服务体系，全程跟进，确保满意。

咨询与订购
感谢您选择我们的服务，如果您有任何问题，请联系我们，我们将竭诚为您解答和服务。

细胞端粒酶活性分析

细胞端粒酶活性分析
端粒酶活性分析简介
       端粒是真核细胞染色体末端的一段特殊序列，由上千个6碱基重复序列(TTAGGG)组成。在体细胞中，随着细胞的分裂，端粒长度会变短。端粒酶是基本的核蛋白逆转录酶，在细胞染色体复制过程中，能够以自身RNA为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。端粒酶的活性端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，但是在一些“不死细胞”如肿瘤细胞、生殖细胞中则具有很高的活性，补偿DNA复制导致的端粒缩短从而维持端粒长度的稳定。因此可以假设端粒长度可能起到“有丝分裂钟”的作用，来可作为测量细胞分裂的次数的标志，终作为细胞衰老和凋亡的信号。因此，检测细胞中端粒酶的活性对干细胞、肿瘤生物学的研究具有很重要的意义，已有研究表明，在20多种肿瘤细胞中，80%以上可以检测到粒酶活性。
      利用端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列的原理，1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）。TRAP主要原理如下：先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成AGGGTTAG，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。然后对PCR产物使用不同的方法进行检测，从而达到检测端粒酶活性的目的，目前主要的方法有同位素法、染色法、荧光法、ELISA法。目前大部分的端粒酶检测试剂盒均是按照这个原理发展起来的。
 
 
检测结果示例
通过TRAP-PCR染色法检测鉴定样品中端粒酶活性

检测原理
       端粒DNA与细胞的寿命密切相关，而合成又依赖于端粒酶。正常人体细胞中不能检测出端粒酶活性的表达，而肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却异常的高表达。TRAP－银染法端粒酶活性检测试剂盒是采用端粒重复序列扩增的方法，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6 bp的梯状条带，条带的深浅表示端粒酶活性的大小。

实验室检测流程
1．细胞端粒酶或组织标本端粒酶的提取。
2．PCR扩增。
3．聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4．银染。

客户提供
1、样品信息：包括来源、种属等。
2、实验样本材料：新鲜细胞样本不少于5×105 个，新鲜血浆样本不少于500ul。
 
服务周期
2-3周（具体视样品数而定）

项目交付
1、提交实验报告书，包括实验材料、试剂、仪器、实验过程方法、结果及分析。
2、原始数据、图片，以及文本电子版。
 
服务流程
1、提交项目课题相关需求和资料。
2、与我们的专业技术团队讨论项目细节。
3、根据讨论后的意见对实验方案进行修改。
4、双方均满意并达成一致，签订技术服务合同。
5、开展实验，按期完成合同规定的内容。
6、结题，提供实验原始结果和分析结果、实验流程、实验条件等等。
 
我们的优势
1、提供各种实验材料和仪器，满足项目课题实验需要。
2、专业的操作人员。
3、高规格实验室。
4、数据结果交付周期快。
5、完善的服务体系，全程跟进，确保满意。
 
咨询与订购
感谢您选择我们的服务，如果您有任何问题，请联系我们，我们将竭诚为您解答和服务。
 

试剂盒：显色和比色分析  　　试剂盒：显色和比色分析