qPCR曲线常见问题有哪些?如何解决?

qPCR曲线常见问题有哪些?如何解决?

在 qPCR 实验过程中,经常会遇到异常扩增曲线和熔解曲线的困扰,那么qPCR曲线常见问题有哪些呢?该如何解决呢?让我们一起来看看吧!

一、扩增曲线相关问题

1.无扩增曲线

可能原因:

(1)没有打开荧光信号采集。检查程序设置,三步法扩增程序在 72℃ 延伸阶段采集信号,两步法扩增程序的信号采集设置在退火延伸步骤。

(2)引物降解。可通过 PAGE 电泳检验引物的完整性。

(3)模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。

2. 扩增曲线不光滑

可能原因:

(1)仪器长时间未校准,在检测中出现了波动,建议定期校准仪器;

(2)RNA 模板不纯,建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。

3. 扩增曲线平台期抖动

可能原因:仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。

4. 扩增曲线右下方下落呈倒扣状

可能的原因:模板浓度过高,基线终点值大于 CT 值,仪器默认起峰位置仍为基线期,将起峰位置往基线下拉,所以扩增曲线变成了倒扣的 S 形(左图)。可适当减小基线范围,手动调整基线终点值至 CT 值 -4,调整基线范围后,扩增曲线即恢复正常(右图)。

二、熔解曲线相关问题

1. 有扩增曲线无溶解曲线

可能原因:检查是否有设置熔解曲线步骤或熔解曲线信号采集是否打开。

2. 熔解曲线杂峰

(1)杂峰在主峰之前

可能的原因:杂峰在主峰之前,Tm 在 70~75℃ 范围内,一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合,在 Taq 酶的作用下,3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 DNA 片段。可根据 NTC(无模板阴性对照)判断是否为引物二聚体。

解决方案:建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。

(2)杂峰在主峰之后

可能的原因:非特异性扩增,可能由于引物特异性较差,或体系中有气溶胶污染(可结合 NTC 确定体系是否有污染)。建议先提高退火温度,可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善,建议更换特异性较高的引物。

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