各种转染试剂的中文说明

各种转染试剂中文说明

一、PEI Prime Powder, Transfection Grade Linear Polyethylenimine(Serochem)转染步骤（以 HEK293 贴壁细胞为例）

1.细胞接种：细胞密度 2-6 x106 cells/mL.

2.质粒的准备：在 5％最终培养体积的 DMEM 或培养基中，每 10 6 个细胞稀释1.0 ug pDNA。

3. PEI 的准备：在 5％最终培养体积的 DMEM 或培养基中，每 10 6 个细胞稀释3.0 ug PEI Prime，混匀通过快速，短暂涡旋或颠倒数次试管，将 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。

4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室温下静置 10 分钟。一边旋转板，一边将 pDNA 和 PEI 混合物逐渐滴加到细胞中。

5.于 37℃ CO₂ 培养箱中培养。

二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤：

说明：以下步骤适用于在 6 孔培养板中转染贴壁细胞。开始时，每 6 孔培养板使用 0.4ug DNA。尽管 DNA 的量看起来很少，但已足够用于转染。如果想获得最高的转染效率，对每种细胞系的转染条件都要进行优化。

转染前一天，用 5ml 含血清和抗生素的培养基分装使每 6 孔培养板含 2-8×105的细胞（根据细胞类型而定）。在细胞的正常培养条件下培养（通常 37℃和 5％CO2）。转染当天细胞应 40–80％融合。转染时，用 DNA 浓缩缓冲液（EC Buffer）稀释 1ug DNA 至 100ul 总体积（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 浓度：0.1ug/ul）。加入 3.2ul Enhancer， 涡旋 1s 以混合溶液。

重要：请保持 DNA 与 Enhancer 比例恒定。

 注意：质粒 DNA 的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此，只应该使用最高纯度的 DNA。室温（15-25℃）孵育 2-5 分钟，离心（spin down）几秒钟以从管顶去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent，反复吸取 5

次或涡旋 10 秒钟以混合。

注意：没必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室温中放置 10-15 分钟不会改变它的稳定性。

室温下（15-25℃）孵育 5-10 分钟以形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出培养液，用 4ml PBS 洗涤一次细胞。加入1.6ml 新鲜培养液（可以包含血清和抗生素）到细胞中。加入 0.6ml 培养液（可以包含血清和抗生素）至包含转染转染复合物的 EP 管中。吸取两次以混合，立即将转染复合物 drop-wise 加入 6 孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育适当的时间直至转染基因表达。孵育时间和由所采用的实验和所使用的基因决定。

Optional: 大多数情况下，不需去除转染复合物。然而，如果观察到细胞毒性，则需在转染后 6-18 小时移除 Effectene-DNA 混合物，用 PBS 洗涤一次细胞， 然后加入 5ml 新鲜细胞培养液。

瞬时转染时，进一步试验分析转染基因的表达。

转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育 24-48 小时以使转染基因的表达。

稳定转染时，在转染后 24-48 小时，将细胞以 1:5~1:10 传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。

注意：我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线（剂量–反应曲线）。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。

以下步骤有时是必须的：将转染的细胞置于它们正常的培养液（如：不含选择性抗生素的培养液），然后孵育 1-2 天，然后再加入选择性培养液。

上海金畔生物科技有限公司提供254培养基 ，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
254培养基

254培养基

When supplemented with HMGS or HMGS-2, Medium 254 will support the plating and proliferation of melanocytes at varying culture densities from 5 x 103 cells/cm2 to 1 x 105 cells/cm2. Additional applications for use may include primary isolation of melanocytes from skin.

Medium 254 is a basal medium containing essential and non-essential amino acids, vitamins, other organic compounds, trace minerals, and inorganic salts. This medium does not contain antibiotics, antimycotics, hormones, growth factors, or proteins. This medium is HEPES and bicarbonate buffered and designed for use in an incubator with an atmosphere of 5% CO2/95% air. To support plating and long-term proliferation of normal human melanocytes, Medium 254 must be supplemented with Human Melanocyte Growth Supplement (HMGS) or PMA-Free Human Melanocyte Growth Supplement-2 (HMGS-2). Each of these supplements contains all of the growth factors, hormones, and tissue extracts necessary for growth of melanocytes in Medium 254.

细胞培养常见问题及对策

1 冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后，须立即放入 37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？

除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO  即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum)  是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum)  则是指小牛血清。HS (horseserum)  则是指马血清。

6 培养细胞时应使用 5 %或 10% CO2？或根本没有影响？

一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统，而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10% CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升 1.5 g 时，则应使用 5% CO2 培养细胞。

7 何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

8 培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

9 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？

一般使用之 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 C，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。

10 悬浮性细胞应如何继代处理？

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。

11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)，5 – 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。

12 细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

13 细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5 – 10% DMSO (dimethyl

sulfoxide) 和 90 – 95 %原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于

DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保存使用之 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 之 DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 C，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜。

15 冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 C 30~60 分钟 → (-20 C 30 分钟) → -80 C16~18 小时(或隔夜) → 氮槽 vapor phase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3 C 至–80 C  以下， 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。*-20 C 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

16 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为 1×106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5×106 cells/ml vial 为宜。

17 应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染的好方法。

18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 加入相应抗生素，直接灭菌后丢弃之。

19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

20 支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

        21 细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

上海金畔生物科技有限公司提供人乳腺上皮细胞基础培养基 ，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
人乳腺上皮细胞基础培养基

Gibco™ Human Mammary Epithelial Cell Basal Medium (formerly ''''Medium 171''人乳腺上皮细胞基础培养基)

This medium contains essential and non-essential amino acids, vitamins, other organic compounds, trace minerals, and inorganic salts. It does not contain antibiotics, antimycotics, hormones, growth factors, or proteins. It is HEPES and bicarbonate buffered and designed for use in an incubator with an atmosphere of 5% CO2/95% air.

To support plating and long-term proliferation of normal human mammary epithelial cells, Human Mammary Epithelial Cell Basal Medium must be supplemented with Mammary Epithelial Growth Supplement (MEGS) (Cat. No. S0155). Each 5-mL bottle of MEGS contains all of the growth factors, hormones, and tissue extracts necessary for the culture of normal human mammary epithelial cells and is the correct amount of supplement for a 500 mL bottle of Human Mammary Epithelial Cell Basal Medium.

When a 500 mL bottle of medium is supplemented with MEGS, the final concentrations of the MEGS components in the supplemented medium are: BPE, 0.4% v/v; recombinant human insulin-like growth factor-I, 0.01 μg/mL; hydrocortisone, 0.5 μg/mL; and recombinant human epidermal growth factor, 3 ng/mL.