PCR引物设计的关键点有哪些？

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是PCR特异性反应的关键，因此，PCR的首要任务就是引物设计。那么你知道PCR引物设计的关键点有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、引物最好在模板cDNA 的保守区内设计

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

二、引物长度一般在15~30 碱基之间

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

三、引物GC 含量在40%~60%之间，Tm 值最好接近72℃

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

四、引物3′端要避开密码子的第3 位

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

五、引物3′端不能选择A，最好选择T

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T 之间，所以3′端最好选择T。

六、引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

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