PCR引物设计的关键点有哪些?

PCR引物设计的关键点有哪些?

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是PCR特异性反应的关键,因此,PCR的首要任务就是引物设计。那么你知道PCR引物设计的关键点有哪些吗?让我们一起来看看吧!

一、引物最好在模板cDNA 的保守区内设计

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

二、引物长度一般在15~30 碱基之间

引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

三、引物GC 含量在40%~60%之间,Tm 值最好接近72℃

GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm 值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

四、引物3′端要避开密码子的第3 位

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

五、引物3′端不能选择A,最好选择T

引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A 时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T 时,错配的引发效率大大降低,G、C 错配的引发效率介于A、T 之间,所以3′端最好选择T。

六、引物应具有特异性

引物设计完成以后,应对其进行BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

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