SARS-CoV-2核酸检测试剂盒说明书
上海金畔生物生物技术有限公司代理凡知医学的SARS-CoV-2病毒核酸检测试剂盒，该试剂盒用于体外定性检测SARS-CoV-2病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例、及其他需要进行SARS-CoV-2病毒诊断或鉴别诊断者的口咽拭子、鼻咽拭子样本中SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因
(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒(实时荧光探针法)
Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Nucleic Acid Detection Kit (Real-Time RT-PCR Method)
FiregenSARS-CoV-2病毒核酸检测试剂盒 产品优势：全组份冻干技术，常温运输，无需冷链，比液体试剂更可靠，创新采用单反应微球设计，简化操作流程
上海金畔生物专业代理各种进口试剂耗材（sigma,abcam，medkoo,streck，terrgene，sarecare,zeptometrix等），*，欢迎垂询
上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
Luna® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒用于 SARS-CoV-2 的实时 RT-PCR 检测
对 2019-nCoV_N1 和 2019-nCoV_N2 靶标以及人源 RNase P 基因进行多重检测，支持高通量检测流程
通过将 RNase P 内标的反向引物设计为跨外显子序列，降低基因组 DNA 的扩增背景
4X 浓度的 RT-qPCR 预混液支持更大的上样量，提高检测灵敏度
Luna 温启动反转录酶和热启动 Taq 酶共同提升反应特异性和功效，可在室温条件下建立体系
预混液中包含热敏 UDG 和 dUTP，防止残留污染
支持混合样品池检测，且不影响灵敏度
欲了解 NEB 如何支持 COVID-19 研究，请点击 COVID-19 research，其中详述了多种 RT-qPCR 病毒检测方案
使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒，在 96 孔板上检测 94 个不同的样本。结果通过荧光通道显示。
Luna® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒经过优化，适用于水解探针法的 SARS-CoV-2 实时 RT-PCR 检测。在同一管中，RNA 首先由反转录酶转化为 cDNA，然后使用 DNA 依赖型 DNA 聚合酶扩增 cDNA，从而可以进行 qPCR 定量。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量 PCR 每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。
图 1：Luna® SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒组分
图 2：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒可在一个反应中同时检测两个 N 基因位点和人源 RNase P 基因
A. SARS-CoV-2 的两组引物探针序列源于 CDC 提供，其中探针改为两种荧光标记（N1: HEX, N2: FAM）。
B. RNase P 内标包含 Cy5 标记的探针和重新设计的反向引物。该引物的跨外显子设计，避免了人基因组 DNA（含有 2.4 kb 内含子）的扩增干扰。
SARS-CoV-2 引物/探针混合物包含 SARS-CoV-2 病毒中 N 基因两个区域的引物和探针 [基于美国疾病控制与预防中心（CDC）提供的序列]。两条探针带有不同的荧光标记（N1: HEX;N2: FAM），可在 qPCR 仪器的两个不同通道中同时观测。为了确保检测样品的完整性和无抑制物，还包含一套用于扩增人源 RNase P 基因的内标（IC）引物和探针。该靶基因的反向引物与 CDC 的设计不同，修改为跨外显子序列，以降低残留基因组 DNA 的扩增背景。IC 的扩增可在 Cy5 通道观测。产品同时还提供阳性对照（PC）（含有 SARS-CoV-2 N 基因的质粒）。
该试剂盒包含 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（NEB #M3019），支持更大的上样量和混合样品池检测，对灵敏度和特异性的影响极小。该预混液包含一步法 RT-qPCR 的所有组分，和独特校对参比染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。独具特色的是：预混液还包含防止残留污染的热敏 UDG 和 dUTP，以及有助于体系建立的无荧光可见示踪染料。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠，因此不会干扰实时检测。
图 3：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限比 TaqPath™1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 更低
将下述两种试剂盒进行检测下限（LOD）比较：使用 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行多重 RT-qPCR 检测，实验设置参照 E3019 产品说明书；使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_ N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR 检测，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪 （96 孔板，20 µl 反应体系）。结果显示 Luna 试剂盒对两个靶标的检测下限为 5 拷贝/反应，而 TaqPath 为 10 拷贝/反应。
图 4：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒适用于纯化 RNA 的混合样品池检测
通过将一份 2 µl 的模拟阳性样品（10 拷贝的 Twist 合成 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA）与四份 2 µl 的模拟阴性样品（仅含 10 ng Jurkat 总 RNA）混合，制备出包含五份样品的混合样品池。将混合样品池（10 µl）与单独样品（2 µl，含 10 拷贝 N 基因和 10 ng Jurkat 总 RNA）进行性能比较。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。N1 和 N2 靶标的扩增曲线显示，单独和掺入混合样品池的阳性样品 Cq 值相似。由于混合样品池中人源总 RNA 量是单独样品的 5 倍，因此正如预期，混合样品池 RNase P 基因的 Cq 值更小。
图 5：Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒的检测下限（LOD）
通过 Luna SARS-CoV-2 多重 RT-qPCR 检测试剂盒对多种 SARS-CoV-2 RNA 对照样品中的 2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）靶标进行多重 RT-qPCR 检测，获得该试剂盒的检测下限（LOD）。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中（图 A）。两位实验人员同时使用三种仪器进行平行测试（96 孔板，20 µl 反应体系）：Applied Biosystems（ABI）7500 Fast Real-Time instrument、ABI QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR system，以及 Bio-Rad CFX instrument。结果显示：Twist RNA 的检测下限均为 5 拷贝/反应。此外还测试了其它样品类型（图 B）：SARS-CoV-2 基因组 RNA 源自 ATCC（ATCC® VR-1986D™）、NIST（Fragment 1 – Includes SARS-CoV-2 sequence: 25949-29698 of isolate USA-WA1/2020），以及 SeraCare AccuPlex™ SARS-CoV-2 Verification Panel V2（0505-0132）。上述 RNA 均由 Monarch 总 RNA 小量提取试剂盒（NEB# T2010）提取。所有 RNA 样品均掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA，使用 ABI 7500 Fast Real-Time instrument 检测。假设 RNA 提取的回收率为 100%，则各样品检测下限为：ATCC 的 SARS-CoV-2 基因组 RNA 为 2.5 GE（genomic copy equivalent）、NIST SARS-CoV-2 测试样品为 1×107 倍稀释、SeraCare AccuPlex 样品为 15 拷贝。
图 6：与 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix CG相比，Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 SARS-CoV-2 N2 靶标的检测性能更好
A. 使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对 2019-nCoV_1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照 E3019 产品说明书。B. 使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围扩增结果。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。在上述条件下，Luna 和 TaqPath 对 N1 靶标的扩增结果都很好。对于 N2 靶标，尽管 TaqPath 可检测 10 个拷贝样品，但线性度并不理想，而 Luna 线性度更好，且 Cq 值出现更早。
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 结合了热启动 Taq DNA 聚合酶和具有新型温启动活性的反转录酶，可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性，这种温控活化机制可避免热循环前的非特异引物结合和扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性，最佳反应温度为 55°C。
图 7：Luna RT-qPCR 预混液的室温稳定性让实验流程更灵活
使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG 对2019-nCoV_N1（HEX）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重（SP）和多重（MP）RT-qPCR，实验设置参照 E3019 产品说明书。使用 TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG 对 2019-nCoV_N1（FAM）和 2019-nCoV_N2（FAM）进行单重 RT-qPCR，实验设置参照美国疾控中心 2019-nCoV 实时 RT-PCR 诊断指南。实验样品：将 Twist 公司合成的 SARS-CoV-2 RNA 对照 2 掺入到 10 ng Jurkat 总 RNA 中，实验评估了样品 5-log 浓度范围（100,000-10 拷贝）的扩增结果。上机前，将 RT-qPCR 反应体系分别室温孵育 0、2、5、24 小时。实验仪器为 Applied Biosystems® 7500 Fast 实时荧光定量仪（96 孔板，20 µl 反应体系）。结果显示 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 预混液孵育 0-24 小时的实验结果一致，而 TaqPath 孵育 2 小时后，Cq值延迟≥1，实验效果随孵育时间的延长而下降。
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SARS-CoV-2 阳性对照（N 基因）以质粒形式提供，其中含 SARS-CoV-2 N-基因（GenBank：MN908947.3），以及 T7 RNA 启动子序列，如有需要可生成 RNA 转录本。该产品用于靶向 N 基因的 SARS-CoV-2 检测方法（如：RT-qPCR、LAMP 等）的验证。浓度为 1,000,000 拷贝/μl。
注意：在绝对定量实验中，不建议将该阳性对照的浓度作为绝对拷贝数。
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· 新型 SARS-CoV-2 突变体对本套引物有何影响？登陆 Primer Monitor 在线工具（更多信息），查看突变体图谱与引物匹配的最新信息。
· 以 10X 浓度提供
· 靶向 SARS-CoV-2 基因组中的 N 基因和 E 基因区域
· 优化形成 2 组引物混合物，提升了 SARS-CoV-2 病毒 RNA 检测的速度和灵敏度
· 为 SARS-CoV-2 快速变色 LAMP 检测试剂盒（NEB #E2019）的组分之一
· 点击如下链接，查看如何使用本套引物和 WarmStart® LAMP（含UDG）试剂检测 SARS-CoV-2 病毒 RNA。https://international.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/appnote_optimizing_rapid_isothermal-workflow_for_sars-cov-2_with_warmstart_lamp_with_udg.pdf?rev=1972ec224ec54ce38f58669cd791e63d
· 如需自己设计 LAMP 引物，请使用 NEB LAMP Primer Design Tool
·了解 LAMP 和其它等温扩增方法，请点击https://international.neb.com/applications/dna-amplification-pcr-and-qpcr/isothermal-amplification
· 全球 LAMP（gLAMP）联盟发表了一篇综述文献，全面回顾了 LAMP 及其在 COVID-19 疫情中的作用。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8802757/
LAMP SARS-CoV-2 引物预混液（N/E）是一套靶向两个基因的混合引物，可识别 SARS-CoV-2 基因组中的核衣壳蛋白基因（N）和包膜蛋白基因（E）区域。包含分别靶向两个区域的 2 组 LAMP 引物（F3、B3、FIP、BIP、LF、LB），能提高对 SARS-CoV-2 的检测能力。
LAMP SARS-CoV-2 引物序列（5´→ 3´）
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Gene N2 Primer Set |
Sequence |
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E1-F3 |
TGAGTACGAACTTATGTACTCAT |
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E1-B3 |
TTCAGATTTTTAACACGAGAGT |
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E1-FIP |
ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG |
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E1-BIP |
TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT |
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E1-LF |
CGCTATTAACTATTAACG |
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E1-LB |
GCGCTTCGATTGTGTGCGT |
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Gene N2 Primer Set |
Sequence |
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N2-F3 |
ACCAGGAACTAATCAGACAAG |
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N2-B3 |
GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT |
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N2-FIP |
TTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC |
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N2-BIP |
CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA |
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N2-LF |
GGGGGCAAATTGTGCAATTTG |
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N2-LB |
CTTCGGGAACGTGGTTGACC |
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NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 配套试剂盒（Oxford Nanopore Technologies）
• 简化、高效的操作流程
目前对 SARS-CoV-2 测序的可靠性和准确性的要求日益增长，为了满足上述需求，NEB 推出 NEBNext® ARTIC 文库制备试剂盒。这些试剂盒根据 ARTIC Network（1）原始流程开发，可分别用于长片段和短片段测序。ARTIC SARS-CoV-2 测序是基于多重扩增子技术的病毒全基因组测序。
使用 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台），提高基因组覆盖度。基因组数据可视化图（IGV）显示了 SARS-CoV-2 基因组的覆盖度。起始样本是 100 ng 人类通用参考 RNA（ThermoFisher QS0639）中的 1,000 份 SARS-CoV-2 病毒 gRNA 拷贝（ATCC VR-1986 和 VR-1991）。分别使用两种引物对起始样本进行多重扩增子扩增：IDT ARTIC nCoV-2019 V3 Panel（“Standard”）和 NEBNext 已平衡的 ARTIC SARS-CoV-2 引物池，两种引物中添加或不添加 NEBNext ARTIC 人类对照引物。建库试剂为 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台）。使用 MiSeq® （2 x 75 bp）测序。测定每个碱基的覆盖深度，向下抽样（seqtk）Reads 数，使用 Bowtie 2 比对至 SARS-CoV-2 参考基因组（NCBI, NC_045512）。
使用 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台），提高基因组覆盖度。基因组数据可视化图（IGV）显示了 SARS-CoV-2 基因组的覆盖度。起始样本是 100 ng 人类通用参考 RNA（ThermoFisher QS0639）中的 1,000 份 SARS-CoV-2 病毒 gRNA 拷贝（ATCC VR-1986 和 VR-1991）。分别使用两种引物对起始样本进行多重扩增子扩增：QIAseq SARS-CoV-2 Primer Panel 和 NEBNext 已平衡的 ARTIC SARS-CoV-2 引物池。建库试剂为 QIAseqFX kit 或 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台）。使用 MiSeq® （2 x 75 bp）测序。测定每个碱基的覆盖深度，向下抽样（seqtk）Reads 数，使用 Bowtie 2 比对至 SARS-CoV-2 参考基因组（NCBI, NC_045512）。
使用 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台），提高基因组覆盖度。起始样本是 100 ng 人类通用参考 RNA（ThermoFisher QS0639）中的 1,000 份 SARS-CoV-2 病毒 gRNA 拷贝（ATCC VR-1986 和 VR-1991）。分别使用两种引物对起始样本进行多重扩增子扩增：QIAseq SARS-CoV-2 Primer Panel 和 NEBNext 已平衡的 ARTIC SARS-CoV-2 引物池。建库试剂为 QIAseqFX kit 或 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台）。使用 MiSeq® （2 x 75 bp）测序。基因组部分的各覆盖深度由起始量和 Reads 向下抽样至 10,000、100,000、500,000 和 1,000,000 确定。
NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台）工作流程
上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。
NEBNext® ARTIC SARS-CoV-2 文库制备试剂盒（适用于 Illumina 平台）
• 简化、高效的操作流程
使用 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 配套试剂盒（Oxford Nanopore Technologies），完全覆盖基因组所需的 Reads 数更少。基因组数据可视化图（IGV）显示了 SARS-CoV-2 基因组的覆盖度。起始样本是 100 ng 人类通用参考 RNA（ThermoFisher QS0639）中的 1000 份 SARS-CoV-2 病毒 gRNA 拷贝（ATCC VR-1986 和 VR-1991）。分别使用两种引物对起始样本进行多重扩增子扩增：IDT ARTIC nCoV-2019 V3 Panel（“Standard”）和 NEBNext 已平衡的 ARTIC SARS-CoV-2 引物池。所使用的建库试剂盒如下：NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 配套试剂盒（Oxford Nanopore Technologies）、Oxford Nanopore Technologies Native Barcoding Expansion kits 1-12（EXP-NBD104）、13-24 (EXP-NBD114)、Ligation Sequencing Kit（EXP-NBD114）、Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK109）和 SFB Expansion Kit（EXP-SFB001）。使用 R9.4.1 flow cells 在 GridION 仪器上进行测序，并使用 ARTIC Network nCoV-19 生物信息流程分析数据。
使用 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 配套试剂盒（Oxford Nanopore Technologies）提高基因组覆盖度。如图所示，起始样本是 100 ng 人类通用参考 RNA（ThermoFisher QS0639）中的 1000 份 SARS-CoV-2 病毒 gRNA 拷贝（ATCC VR-1991）。分别使用两种引物对起始样本进行多重扩增子扩增：IDT ARTIC nCoV-2019 V3 Panel 和 NEBNext 已平衡的 ARTIC SARS-CoV-2 引物池。操作流程也分别使用两种：标准操作流程和 NEBNext 操作流程。所使用的建库试剂如下：NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 配套试剂盒（Oxford Nanopore Technologies）、Oxford Nanopore Technologies Native Barcoding Expansion kits 1-12（EXP-NBD104）、13-24 (EXP-NBD114)、Ligation Sequencing Kit（EXP-NBD114）、Ligation Sequencing Kit（SQK-LSK109）和 SFB Expansion Kit（EXP-SFB001）。使用 R9.4.1 flow cells 在 GridION 仪器上进行测序。Reads 数被向下抽样（seqtk）至指定值，并使用 ARTIC Network nCoV-19 生物信息流程生成共有序列基因组。使用 Quast 将共有序列基因组与 SARS-CoV-2 参考序列进行比对获得基因组覆盖率。在覆盖率达到 100 倍时共有序列中仅缺失了最 5′ 和 3′ 的区域（约 120 个核苷酸）。
SARS-CoV-2 RT-PCR 扩增性能优越。起始样本是 100 ng 人类通用参考 RNA（ThermoFisher QS0639）中的 10 – 10,000 份 SARS-CoV-2 病毒 gRNA 拷贝（ATCC VR-1986 和 VR-1991）。使用 NEBNext 已平衡的 ARTIC SARS-CoV-2 引物池对起始样本进行多重扩增子扩增。使用 Qubit™ dsDNA BR Assay Kit（ThermoFisher Q32850）测定平均扩增子产量。
适用于 Oxford Nanopore Technologies 测序的 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 工作流程
