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现货供应：BioDynami NGS DNA建库试剂盒——illumina和MGI平台

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现货供应：BioDynami NGS DNA建库试剂盒——illumina和MGI平台

Biodynami公司于2012年在美国亨茨维尔成立，是一家集研发、生产、销售为一体的生物技术公司。产品聚焦二代测序（NGS）及分子克隆模块，其中NGS产品2016年进入中国市场，以其快捷、高效的特性受到科研、制药等用户的信赖。

高通量测序(NGS)技术因通量高、速度快等优势在基因检测中的应用越来越广泛，在基础研究和临床辅助诊断方面发挥了巨大作用，NGS实验流程包括核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析等步骤，其中文库构建是非常关键的一环，对整个实验结果影响最大。

NGS DNA文库制备试剂盒是为构建用于下一代测序的高质量文库而开发的（illumina平台）。该试剂盒需要双链DNA片段（钝性/粘性）作为NGS文库构建的输入DNA，并且与酶法和机械法产生的DNA片段兼容。

该试剂盒有三种index类型：

Non-index（目录号#30009S和30009L）：文库没有索引。

Index（目录号#30021S和30021L）：我们的每个索引引物都包含一个具有6个碱基的du特条形码序列，可用于识别文库。库多路复用最多可以有48个样本。

Unique dual index（目录号#30023S和30023L）：使用wei一的双索引，可以对多达96个样本进行库多路复用。我们开发了一个4个碱基的差异指标体系。该系统允许我们在8个碱基的索引长度中创建至少有4个碱基彼此不同的索引。我们du特的双索引引物消除了测序错误，例如索引跳跃，索引交叉污染，读取错误分配，扩增错误和解复用错误。引物组包括96孔板中96对预混合的i5和i7索引引物。

上海金畔生物科技有限公司现货供应BioDynami NGS DNA建库试剂盒——illumina和MGI平台(30009/30021/30023/34021)

NGS测序之文库构建

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NGS测序之文库构建

由于二代测序读长的限制，不可能一下将一个很长的基因序列测通，因此需要先将长基因序列随机片段化成小片段，这样的话，这些片段就可以覆盖整个基因组。所以需要构建文库。

一、文库构建的步骤

文库构建大致步骤类似，但是各有各自du特的点，例如，RNAseq里miRNA，lncRNA，mRNA方法各有差异，具体方法以后有机会再补充。这里以Illumina的 PE文库为例，其流程图如下图。

 

二、文库构建详细步骤

（1）DNA片段化 （Fragment DNA）

使用超声、酶或者加热的方式将DNA样品打碎成小片段，一般在300 ~ 800bp之间除非有特殊要求。

（2）末端修复（End Repair）

补平片段化时导致的不平末端。

（3）3' 末端加“A” （A-tailing）

3‘ 末端加A，转换为粘性末端，与adapter 互补配对，因为adapter 3‘端有一个突出的T。

（4）接头连接（ ligation adaptor）

这一步有两种不同的添加策略如下图。

 

左边的图是直接在fragment DNA的两端直接加上full Y-adapter, adapter中已经包括了和P5/P7 oligo互补的序列, index, 以及Read1/Read2的测序引物。

右边的图是先在fragment DNA的两端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互补配对的序列以及index序列，分两步：

A. PE adapter添加利用碱基互补配对的原则，加上PE adapter。PE adpater中一部分是建库PCR富集时候需要用的引物序列，另一部分是测序时需要用的引物。

B.PCR 添加 index，P5，P7

Index也称barcode，用来区分不同样本的文库，因为测序仪一个lane产生数据量若干Gb，为了最da化利用测序仪，一次上机常会进行多个样本文库混合测序，在后续分析时，Index用来区分数据是来自哪个样本。

       ● PCR富集目的片段

进行PCR扩增，循环数与投入的DNA量有关，使得文库达到上机浓度。

● 扩增文库大小质检

使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测。

● 文库浓度定量

Qubit3.0 进行初步定量 Q-PCR对文库的有效浓度进行准确定量，至此文库构建结束。

更多有关NGS测序之文库构建的相关内容，请联系BioDynami建库试剂盒代理商——上海金畔生物科技有限公司：






NGS测序为什么需要文库构建?

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NGS测序为什么需要文库构建?

NGS即Next-generation sequencing，又叫第二代测序技术或者高通量测序技术或者下一代测序技术。

文库是DNA/RNA样本在测序前做的一系列准备，因为原始的核酸样本无法直接用于测序，只有经过处理的样本才能满足测序平台的要求，比如在DNA样本两端添加测序bi备的接头；样本量不足时，可以通过PCR扩增达到上机的要求等。NGS测序为什么需要文库构建?让我们一起来看看吧！

一、DNA文库构建的内容

（1）片段化及末端修复 

（2）加接头

（3）PCR

注意：此处忽略磁珠纯化的步骤。

RNA样本的文库构建更加复杂，需将RNA逆转录为cDNA才能进行上述的建库流程，原理相同。

二、gDNA样本在NGS建库前要进行片段化的原因

Illumina测序仪可读取的片段长度范围在50-600bp（图1）, 不同测序芯片和测序试剂，对应测序长度不同。而大部分完整人类gDNA长度≥10kb。所以对于大片段的DNA/RNA样本，打断是文库构建的前提。(这个理由同样适用于MGI平台)

DNA测序应用

应用

推荐读长

全基因组测序

2 X 150 bp

全外显子测序

2 X 150 bp

靶向捕获测序

2 X 150 bp

扩增测序

整个扩增子插入片段长度

从头测序

2 X 150 – 2 X 300 bp

RNA测序应用

应用

推荐读长

转录组分析

2 X 75 bp

基因表达谱分析

1 X 50 bp

小RNA测序

1 X 50 bp


图1.Illumina测序平台针对不同应用推荐的测序读长

三、DNA片段化后要加接头(adapter/index)的原因和意义

一个完整的接头包含三部分:通用引物(P5&P7) + index(i7/i5) + 测序引物(SP1&SP2)（图2）

1. 通用引物用于簇生成，测序引物用于插入片段的测序；
2. 测序平台决定接头序列;
3. index用于区分同一批测序数据的不同样本。当同一张芯片测序样本数≥2时，由index来区分样本。如果一张flow cell只上一个样本，index可以不需要，但是通用引物(P5&P7)和测序引物(SP1&SP2)是必需的。

备注：样本加上完整接头的方式有至少有3种，但是最终文库的接头序列是一致，找时间专门写一个接头不同结构与连接方式的文章。

 图2 不同接头结构的文库

四、PCR和PCR-free两种文库的常见性问题

PCR是实现样本量的手段之一。当投入的起始量较低，构建的文库量较少，需要通过 PCR复制模板量，最终达到上机需求的量。反之，当样本起始量足够多的情况下，只需完成接头连接，纯化后即可上机测序。

但是PCR文库比较常见。
1. 大部分样本的起始量并不能直接满足上机需求
2. 不经过PCR扩增的文库，由于接头呈现Y型，其物理结构特殊，容易导致文库质控结果出现偏差

3. 接头与模板比例高，纯化不干净，导致文库的接头残留严重，降低整个文库质量

五、不同试剂盒对样本起始量要求不同

不同试剂盒会有不同的样本起始量要求。试剂盒能满足的样本起始量主要是由它自身酶的灵敏度、特异性以及稳定性决定的。样本起始量越低 (如新冠鼻咽拭子样本)，对酶的要求越高，相对的价格也越高。而且针对低起始量样本建库的试剂盒都有各自的技术zhuan利和优势，所以也是价格高的另一个原因。

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