NGS测序为什么需要文库构建?

NGS即Next-generation sequencing，又叫第二代测序技术或者高通量测序技术或者下一代测序技术。

文库是DNA/RNA样本在测序前做的一系列准备，因为原始的核酸样本无法直接用于测序，只有经过处理的样本才能满足测序平台的要求，比如在DNA样本两端添加测序bi备的接头；样本量不足时，可以通过PCR扩增达到上机的要求等。NGS测序为什么需要文库构建?让我们一起来看看吧！

一、DNA文库构建的内容

（1）片段化及末端修复 

（2）加接头

（3）PCR

注意：此处忽略磁珠纯化的步骤。

RNA样本的文库构建更加复杂，需将RNA逆转录为cDNA才能进行上述的建库流程，原理相同。

二、gDNA样本在NGS建库前要进行片段化的原因

Illumina测序仪可读取的片段长度范围在50-600bp（图1）, 不同测序芯片和测序试剂，对应测序长度不同。而大部分完整人类gDNA长度≥10kb。所以对于大片段的DNA/RNA样本，打断是文库构建的前提。(这个理由同样适用于MGI平台)

图1.Illumina测序平台针对不同应用推荐的测序读长

三、DNA片段化后要加接头(adapter/index)的原因和意义

一个完整的接头包含三部分:通用引物(P5&P7) + index(i7/i5) + 测序引物(SP1&SP2)（图2）

1. 通用引物用于簇生成，测序引物用于插入片段的测序；
2. 测序平台决定接头序列;
3. index用于区分同一批测序数据的不同样本。当同一张芯片测序样本数≥2时，由index来区分样本。如果一张flow cell只上一个样本，index可以不需要，但是通用引物(P5&P7)和测序引物(SP1&SP2)是必需的。

备注：样本加上完整接头的方式有至少有3种，但是最终文库的接头序列是一致，找时间专门写一个接头不同结构与连接方式的文章。

 图2 不同接头结构的文库

四、PCR和PCR-free两种文库的常见性问题

PCR是实现样本量的手段之一。当投入的起始量较低，构建的文库量较少，需要通过 PCR复制模板量，最终达到上机需求的量。反之，当样本起始量足够多的情况下，只需完成接头连接，纯化后即可上机测序。

但是PCR文库比较常见。
1. 大部分样本的起始量并不能直接满足上机需求
2. 不经过PCR扩增的文库，由于接头呈现Y型，其物理结构特殊，容易导致文库质控结果出现偏差

3. 接头与模板比例高，纯化不干净，导致文库的接头残留严重，降低整个文库质量

五、不同试剂盒对样本起始量要求不同

不同试剂盒会有不同的样本起始量要求。试剂盒能满足的样本起始量主要是由它自身酶的灵敏度、特异性以及稳定性决定的。样本起始量越低 (如新冠鼻咽拭子样本)，对酶的要求越高，相对的价格也越高。而且针对低起始量样本建库的试剂盒都有各自的技术zhuan利和优势，所以也是价格高的另一个原因。

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