FITC荧光标记的原理是什么？具体操作步骤如下：

　　(一)原理

目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate，FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200，RB200)。在性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的E氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

　　(二)操作步骤

将纯化的IgG抗体对PH9~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中称取适量FITC，加入二甲亚硕(DMSO)(FITC-1mg/1ml DMSO)使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO FITC/IgG比例：如IgG浓度为1mg/ml，FITC/IgG比例约为50ugFITC/mgIgG;

如IgG为5~10mg/m1，则比例为25μgFITC/mlIgG 在10ml小烧杯中先放入抗体

按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中将标记物用PBS加至2.5m1，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h。

用PD10柱(SephadexG25柱)除去游离荧光素，先用25m1PBS淋洗G25柱收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F/P比值，第二个荧光素峰为游离荧光素。

计算得：合适的F/P值为2~4。

　　(三)试剂器材

1.纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyhaialte)或其它荧光色素。

3.PBS、DMSO 4.PH9~9.5碳酸盐缓冲液：Na:CO34.3g,NaHCO38.6g加蒸馏水至500ml。

5.PD10柱(SephadexG25柱)

6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等

　　(四)注意事项

1.FITC保存于4℃D暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。

2.FITC-DMS0液要临用时配制。

3.碳酸盐缓冲液要新鲜配制。

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