Elabscience生物素标记试剂盒怎么用？

Elabscience生物素标记试剂盒提供了标记所需的全部试剂，能简单有效地对含有伯氨基（-NH2）分子的蛋白标记。那么你知道Elabscience生物素标记试剂盒怎么用吗？让我们一起来看看吧！

一、实验物品

1. 高精度移液器及一次性吸头：0.5-10 μL、2-20 μL、20-200 μL、200-1000 μL

2. 37°C 恒温箱

3. 离心机（离心力可到 12000×g）

二、操作

1. 实验前准备

（1）试剂耗材准备：提前 20 min 从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的试剂组分继续放置在冰箱中）。

（2）超滤管浸润：向干燥的超滤管滤芯中加入 500 μL Labeling Buffer I，室温放置 10 min 备用，在加入待标记物之前弃去 Labeling Buffer I 即可（整个标记过程中超滤管滤芯都应该保持湿润）。

（3）溶解 NHS-Biotin：用 30 μL DMF 溶解 0.1 mg NHS-Biotin，静置 10 min，待其充分溶解，此时 NHS-Biotin 的浓度为 10 mM，盖好管子备用。

2.标记流程

3. 标记步骤（本操作步骤按照 1 mg 蛋白的量进行标记）

（1）浓缩换液：将 Filter device 正置于配套 Collection tube 里，取 1 mg 待标记蛋白加入 Filter device 中，并用 Labeling Buffer I 补充总体积到0.5 mL，盖好 Filter tube，以 12000×g 的转速离心 10 min，弃去Collection tube 中的液体。

注：

a) Filter device 的最大容积为 0.5 mL。

b) 如果1 mg蛋白体积大于0.5 mL，请分多次加入，离心超滤浓缩。

c) 如果待标记物中含有游离的氨基（Tris，氨基酸或者其他干扰物，需要用 Labeling Buffer I 反复超滤确保其去除干净）。

（2）回收定量：将Filter device倒置于配套Collection tube里，1000×g离心2 min，回收浓缩换液后的蛋白，取出 Filter device，向Collection tube 中加入适量 Labeling Buffer I至蛋白浓度约为2 mg/mL，同时在Filter device中加入0.5 mL Labeling Buffer I，置于管架上备用。

（3）标记反应：立即向蛋白溶液中加入 26.6 μL 的 10 mM NHS-Biotin，轻轻吹打混匀，盖上盖子密封，放入 37°C 恒温箱中避光温育 30 min。

（4）封闭终止：按比例每 100 μg 蛋白加入 10 μL 的 1 M Tris（pH 8.7），混匀后室温放置 10 min。

（5）超滤纯化：加入适量的1×PBS至上述反应液中，使终体积为0.5mL，轻轻吹打混匀，将反应溶液转移至甩干的 Filter device（若上述反应液已超过 0.5 mL，可超滤后分多次转移至甩干的 Filter device中），并与 Collection tube 配套后盖好 Filtration tube，12000× g的转速离心 10 min~30 min。后弃去 Collection tube 中液体，向Filter device中补足1×PBS至500 μL，重复离心超滤操作2~3 次。

（6）收集产物：加 0.2 mL 1×PBS至Filter device 中，轻轻吹打。将 Filter device 倒置于另一个 Collection tube中，1000×g 离心 2 min。收集Collection tube 中的溶液，即为生物素标记的蛋白。

3. 蛋白保存及使用

向标记后的蛋白中加入0.05~0.2% Proclin 300或0.05%die氮化钠，及蛋白稳定剂（如 0.1% BSA），于2~8°C 避光保存，可稳定保存半年。或加入等体积甘油于-20°C 存储，可稳定保存半年。

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