Elabscience一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒怎么用？
Elabscience一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒是一款灵敏度高且能快速简便的检测细胞凋亡的产品。本试剂盒适用于组织样本(石蜡切片、冰冻切片)和细胞样本(细胞涂片、细胞爬片)的原位凋亡检测，检测结果可通过荧光显微镜直接观察。那么你知道Elabscience一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒该怎么用吗？让我们一起来看看吧！
一、试剂配制
1) 1×蛋白酶K工作液：取1μL Proteinase K (100×) 加入99μLPBS中，混匀。现用现配。
2) 1×DNase I Buffer 工作液：按照 9:1 的比例用 ddH2O 将DNase I Buffer (10×) 稀释待用。现配现用。
3) DNase I 工作液（200 U/mL）：用 1×DNase I Buffer 工作液，按照 99：1 稀释比将 DNase I (20 U/μL) 稀释待用。现配现用。
注：DNase I 会在剧烈混合下变性，建议不要涡旋
DNase I 溶液。
4) DAPI工作液：取4μLDAPI Reagent(25μg/mL)加入96μL PBS中混匀。现配现用。
二、固定与通透
1. 细胞样本
1) 细胞爬片：将细胞爬片浸入PBS漂洗1次，滤纸吸干周围水分，再浸入固定液（自备），室温固定 15~20 min 或4°C固定1~2 h。
细胞涂片：收集细胞，加入一定体积的 PBS 重悬细胞沉淀，然后加入和PBS等体积的固定液（自备），室温固定15~20 min 或 4°C固定1~2 h。600×g 离心 5 min，PBS重悬，取25~50μL细胞悬液涂片在载玻片上晾干。
注：细胞固定是分析凋亡样本的重要步骤。未固定的细胞可能会丢失较小的 DNA片段，导致较低的信号。
2) 固定好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
3) 将样本浸入通透液（自备）中，37°C 作用 10 min。
4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
2. 石蜡切片
1) 用常规方法将切片脱蜡水化。将切片浸入二甲苯（自备）脱蜡2次，每次10 min；无水乙醇（自备）浸泡切片2次，每次5 min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自备）各一次，每次 3 min。
注：低温可能影响二甲苯脱蜡效果。当室温低于 20°C 时，二甲苯脱蜡时间可延长至 20 min。
2) 脱蜡好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
3) 滤纸吸干切片组织周围的水分，每个样本上滴加100 μL 1×蛋白酶 K 工作液，37°C 反应 20 min。
注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进行预实验，确定反应时间。
4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗3次，每次5min。
3. 冰冻切片
1) 取出冰冻切片，平衡至室温，再浸入固定液（自备），室温（15~25°C）固定 30 min。
2) 固定好的样本浸入 PBS 漂洗2次，每次5 min。
3) 每个样本上滴加100 μL 1×蛋白酶K工作液，37°C 反应10~20 min。
注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进行预实验，确定反应时间。
4) 将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
三、标记
1. 分组设置
|
分组 |
样本选择 |
特点 |
目的 |
|
阳性对照 |
任选一张实验组切片 |
可选做，DNase I处理切断 DNA，产生暴露的 3'-OH末端，作为阳性样本 |
验证实验流程和试剂的有效性 |
|
阴性对照 |
任选一张实验组切片 |
可选做，标记工作液中不含 TdT酶 |
排除样本自发荧光及样本和染色试剂的非特异性染色；调整曝光强度 |
|
实验组 |
待检测切片样本 |
必做，孵育标记工作液，保持实验检测条件的一致性 |
实验数据来源 |
阳性对照
1) 滴加100 μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的样本上, 室温平衡5 min。
2) 用吸水纸去除样本上多余的液体。加入100 μL稀释后的DNase I工作液（200 U/mL)，37°C孵育10~30 min。
3) 样本浸入 PBS 漂洗3次，每次5 min。
阴性对照
1) 滴加 100 μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的样本上，室温平衡 5 min。
2) DNase I Buffer孵育阴性样本，37°C 孵育10~30 min。
3) 样本浸入PBS漂洗3次，每次 5 min。
实验组
1）实验组通透完成后在PBS中静置，等待阳性对照和阴性
对照处理后共同进行标记染色。
2. 标记工作液的配制
计算好样本量集中配置，每个样本用量按照下表配制，充分混匀，现用现配。
|
组分 |
阳性对照/实验组 |
阴性对照 |
|
TdT Equilibration Buffer |
35 μL |
40 μL |
|
Labeling Solution |
10 μL |
10 μL |
|
TdT Enzyme |
5 μL |
0 μL |
3. 标记步骤
1) 每个样本滴加100 μL TdT Equilibration Buffer，37°C 湿盒中平衡 10~30 min。
2) 吸水纸吸除TdT Equilibration Buffer（注意不要干片）。每个样本滴加50 μL标记工作液，放入湿盒中37°C避光反应60 min。
注：如果信号强度较弱，则可延长 DNA 标记反应的培养时间。某些系统可能需要在37°C下反应4小时。
3) 样本浸入 PBS 漂洗3次，每次5 min。
4) 吸水纸吸干水分后滴加DAPI工作液，室温避光孵育5min，对细胞核进行复染。
5) 样本浸入PBS漂洗4次，每次 5 min。
6) 用吸水纸吸干多余的液体，用含抗荧光淬灭剂（自备）的封片剂封片。
更多有关Elabscience一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的使用方法，请联系Elabscience试剂盒代理——上海金畔生物科技有限公司。