影响荧光原位杂交实验的因素有哪些？

荧光原位杂交是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是 20 世纪 80 年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。那么影响荧光原位杂交实验的因素有哪些呢？让我们一起来看看吧！

一、固定液的选择及固定时间

①石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林固定12～48h，其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。

②组织标本离体后应尽快固定，较大标本切开固定。如样本固定不及时，荧光信号会减弱。（尤其环境温度较高时更应及时固定）

③固定液体积应不少于标本体积的10倍，否则固定不充分，容易出现无信号或者信号很弱的现象。

④为了保证信号的准确性，蜡块最好在2年内进行检测，已经切好的切片在6周内检测最佳。

二、组织切片和载玻片的选择

组织切片4～5μm厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，切片过厚将导致杂交不充分，最终信号点发生重叠，影响计数。而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理时掉片。

载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生。

三、切片的预处理

切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。

①当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时，在煮沸过程中容易掉片，建议烤片温度在56℃过夜。煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。

②酶消化是FISH实验的关键步骤之一，如果对组织不熟悉，可以先消化推荐的反应时间，然后复染DAPI在荧光显微镜下观察，在DAPI通道下，以细胞既无空洞(消化过度)，亦无明显的云雾状(消化不足)为最佳，同时可切换观察红绿通道，以红绿通道无明显的背景为佳，如果背景较高，可适当延长消化时间。

③对于陈旧的石蜡组织切片，要适当延长消化时间，否则会出现大量的自发荧光。

四、变性和杂交

变性和杂交是本实验最关键的步骤，变性的时间和温度是杂交成功是否的关键，变性和退火温度对荧光信号影响较大，变性和退火温度过低会导致杂交效率变低，使荧光信号变弱，变性和退火温度过高易出现高背景。

为保证变性期间温度的稳定，建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤，不仅能够减少实验的繁琐性，而且更有利于实验条件的控制，比如时间、温度和避光条件等。

为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失和防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。

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