绿色荧光素标记牛血清白蛋白BSA-FITC合成详细步骤

绿色荧光标记牛血清白蛋白的方法可以参考荧光标记抗体的方法,因为抗体也是一种蛋白,具体方法如下:


准备材料:


1、异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyhaiateFITC)异构体IIsomerI),M.W389.4发射光谱(吸收光谱)493nm,荧光光谱550nm

2、牛血清白蛋白(BSA),M.W68000,纯度98%。(AlbuminBovineSerum

3、标记缓冲液:0.5MpH9.5C.B,洗脱液:0.01MpH7.2PBS

标记流程:

1:将待交联的蛋白(浓度³1mg/ml)对交联反应液透析三次4 ℃,至pH=9.0。交联反应液配制方法:7.56g NaHCO3,1.06g Na2CO3,7.36g NaCl,加水定容至1 L。

2:将FITC溶于DMSO中,浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制,避光。

3:按P:F(蛋白质:FITC)=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中,边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀,暗处4 ℃反应8 hr。

4:加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L, 4 ℃终止反应2 hr。

5:将交联物在PBS中透析四次以上,至透析液清亮。

6:交联物的鉴定F/P比例:  ,该值应介于2.5 ~ 6.5之间。

7:FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,加入0.1% NaN3、1% BSA,4℃暗处保存。