荧光显微镜技术的基本原理是利用荧光剂使细胞成分具有高度具体的视觉效果，如在目的蛋白后面连接一个通用的荧光蛋白-GFP。在组织样本中，如果目的基因不能克隆，则需要使用其他技术手段来观察目的蛋白，如免疫荧光染色。为此，抗体需要连接各种不同的荧光染料，并直接或间接地与相应的靶结构结合。此外，在荧光染料的帮助下，荧光显微镜技术不仅局限于蛋白质，还可以染色核酸、聚糖等结构，即使是钙离子和其他非生物质。本文详细介绍了几种常用的荧光剂。
免疫荧光(IF)
在荧光显微镜技术中，你可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：使用内源荧光信号，即通过克隆将荧光蛋白与目的蛋白连接起来;或者将荧光标记的抗体特异性与目的蛋白结合起来。第二种方法对一些生物学问题更有用或更必要。例如，荧光蛋白不能用于组织样品，因为一般来说，标本是从不能保存荧光蛋白的生物体中获得的。此外，当有功能抗体可用时，免疫荧光法比荧光蛋白技术快得多，因为后者必须先克隆目的基因，然后将DNA转移到适当的细胞中。荧光蛋白的另一个缺点是它本身属于蛋白质。因此，这些荧光蛋白在细胞中具有特定的蛋白质特性，会导致附着的目的蛋白质功能障碍或误解。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。
免疫荧光法利用抗体与相应抗原特异性相结合的特性，有两种不同的表现形式。最简单的方法是使用荧光标记抗体，它可以与目的蛋白结合。这种方法被称为直接免疫荧光法。
在许多情况下，我们可以使用两种不同特性的抗体。第一种抗体可以与目的蛋白结合，但它本身没有荧光标记(第一种抗性)。第二种抗体本身携带荧光染料(第二种抗性)，并可以与第一种抗性结合。这种方法被称为间接免疫荧光法。这种方法有许多优点。一方面，它会产生放大效应，因为不止一种二次抗性可以与一种抗性相结合。另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白，但市场上可以使用荧光标记的二次抗性。免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括FITC、TRITC或一些Alexaflur染料，如下所述。
FITC和TRITC
异硫氰酸荧光素(FITC)是一种有机荧光染料。目前，该荧光染料仍用于免疫荧光和流细胞手术。在495/517nm处，该染料会产生刺激/发射峰值，并可与异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合。该基团可与蛋白质上的氨基、硫基、咪唑、酪氨酰、碱基等基团结合。其基本成分-荧光素，摩尔质量为332g/mol，常用作荧光示踪剂。FITC(389g/mol)是荧光显微镜技术中首批用于荧光显微镜技术的染料，被视为后续荧光染料的起点，如Alexaflur488。该染料的荧光活性取决于其大共轭芳香电子系统，受蓝光谱中光的刺激。
另一种经常与FITC同时使用的染料是TRITC[四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸]。与FITC相反，TRITC不是荧光素，而是罗丹明家族的衍生物。罗丹明还拥有一个大型共轭芳香电子系统，这导致了它们的荧光行为。另一点是，与FITC相反，TRITC(479g/mol)受绿色光谱中最大波长为550nm的光的刺激，其最大发射波长为573nm。它还基于异硫氰酸盐反应基团与蛋白质(如抗体)结合。
虽然FITC和TRITC仍在使用中，但由于它们最新的显微镜技术，因为它们属于发光相对较弱的荧光染料，其优点只是经济实惠。
图1：果蝇胚胎发育，绿色：FITC;红色：TRITC。
青色素
这种荧光染料相对较少，来自青色素，这也是它名字的起源：Cy2。Cy3。Cy5和Cy7。所有上述青色素都可以通过其反应基与核酸或蛋白质连接。例如，马来酰亚胺基团用蛋白质标记。有趣的是，Cy5对周围的电子环境非常敏感，可用于酶测量。附着蛋白质的构象变化会导致荧光发射阳性或阴性变化。此外，Cy3和Cy5也可用于FRET试验。青色素染料是一种相对较老的荧光染料，但它是其他荧光染料提高亮度、耐光性和量子产率的基础。
AlexaFluor染料。
Alexaflur染料是一种带负电荷和亲水性的荧光染料系列。该系列染料范围广泛，常用于荧光显微镜技术。这些染料的名称是由其发明者Richardpaulhauglhaid以其儿子Alexhauglhaid的名称命名的。产品标识为Molecularprobes(美国生命科学技术公司Lifetechnologies的子公司。注:2014年2月，Lifetechnogies被Thermofisher收购)商标。此外，这些产品标识还涵盖了相应的激光刺激波长。比如Alexaflur488，应用范围广，最大刺激波长为493nm，可由标准488nm激光刺激。Alexaflur48的最大波长是59。488类似于FITC的属性。虽然AlexaFlur488是荧光素衍生物，但与FITC相比，它具有更好的稳定性和荧光亮度，pH敏感性较低。所有AlexaFlur染料(如AlexaFlur546.AlexaFlur633)都是不同基础荧光物质的磺化形式，如荧光素.香豆素.青色素或罗丹明。
图2:小鼠转基因胚胎.肢间体节，E10.5小鼠转基因胚胎的五个肢间体节:EpaxialMyf5egFP;GFP-Alexa488免疫组化染色;用Desmin-Cy3染色胚胎肌纤维，用Hoechstsize自上而下揭示细胞核:3.5mm(a)，800μm(b)。图片来源:AurelieJory，CellulessouchesesesesesesesesesegBMC，IGBMC。
图3:小鼠变成纤维细胞，绿色:F-Actin，FITC;红色:Tubulin，Cy5;蓝色:细胞核，DAPI。图片来源:德国·海德尔堡·马克斯·普朗克研究所·GunterGiese博士。
DNA染色
在荧光显微镜技术中，不仅研究蛋白质结构，而且核酸也具有重要的研究意义。有时，细胞的准确位置和数量必须通过检测细胞核来确定。最常用的DNA染色剂之一是DAPI(4、6-2-2-2-苯基消炎)，它可以与DNA双螺旋A-T富集区结合。如果DAPI附着在DNA上，其荧光强度将高于自由状态。染色剂受最大波长为358nm的紫外线刺激，其发射光谱非常宽，达到461nm的峰值。此外，弱荧光的RNA结合也可以检测到。在这种情况下，发射波长将转移到500nm。有趣的是，DAPI可以穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞。
第二种广泛使用的DNA染色剂是Hoechst染料系列，它们最初是由Hoechstag化学公司生产的。Hoechst33258.Hoechst3342和Hoechst34580均为双苯酰亚胺，可嵌入A-T富集区，因此该系列染料很少使用。与DAPI类似，这三种染色剂都能受到最大发射波长为455nm的紫外线刺激，而未结合的染色剂最大发射波长在510-540nm之间。Hoechst染色剂也具有细胞渗透性，因此可用于活细胞或固定细胞。染色剂和DAPI的区别在于毒性低。
碘化丙啶(Propidium-Iodide，PI)是一种不能通过细胞膜的DNA染色剂。由于上述特性，染色剂不能进入完整的细胞，因此染色剂通常用于区分细胞组中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶也是一种嵌入剂，但对于不同的碱基没有结合差异。染色剂与核酸结合后，最大刺激波长为538nm，最大发射波长为617nm。未结合PI的最大刺激和发射波长和光强较低。PI也可以与RNA结合，无需改变其荧光特性。有时，为了区分DNA和RNA，有必要使用适当的核酸酶。
无需早期处理，就可以识别DNA和RNA。与DNA结合后，最大刺激/发射波长为502nm/525nm，而与RNA结合后，最大刺激/发射波长为460nm/650nm。此外，它还可以进入溶酶体和其他酸性区域。在这里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境下，由蓝色光谱中的光刺激，但发射波长在橙色区域最大。由于凋亡细胞有大量被吞噬的酸性区域，因此常用作这些细胞的标记物。
区室和细胞器特异性染料。
在荧光显微镜技术中，溶酶体、核内体等细胞室和线粒体等细胞器经常被染色。为此，本部分介绍了一系列可供选择的特异性染料。
观察线粒体最常用的方法是使用Mitotracker，它是一种可以通过细胞的染料，包括轻度硫基化的氯甲基活性部分。正因为如此，它可以与半胱氨酸残留物的游离硫醇基发生反应，从而与基质蛋白结合。Mitotracker有不同的颜色和装饰类型(见表1)，此外，它也是Molecularprobes的商标。与罗丹明123(Rh123)或tetramethrosamine等常规线粒体特异性染色剂不同，Mitotracker在用固定剂破坏膜电位后不会被洗掉。
根据线粒体染色剂，一些染料可以标记溶酶体和其他酸性区域，这被称为Lysotracker。它们由连接荧光基团的弱碱基团组成，具有膜穿透性。最有可能的情况是，这些碱基因的质子化对酸性区域有亲和力。Lysotracker有多种不同的颜色可供选择(见表1)。
类似溶酶体的房间是真菌中的液泡，如酿酒酵母，这也是一个酸性环境。如果您想在荧光显微镜下观察上述房间，请使用FM4-64或FM5-95等苯乙烯基染料。
内质网(ER)对蛋白质分泌实验具有重要的研究意义。染色上述区间的典型染料是DiOC6(3)。虽然染料更喜欢ER，但它仍然与线粒体和其他细胞器膜结合。ER特异性染色的另一种方法是使用ER-Trackergren和Red等ER-Tracker，而ER-Trackergren和Red是基于BODIPY的两种染料，它们与格列本脲(一种磺酰脲酶)相连，可以与仅存在于内质网膜上的ATP敏感钾通道相结合。BODIPY(硼-二吡咯亚甲基，boron-diPyromethene)是一种几乎不溶于水的染料基团，对pH相对不敏感。这种染料对蛋白质标记用处不大，但却是脂质和膜标记的好工具。
对于与ER相邻的高尔基体，可以用NBDC6-ceramide、BODIPYFLC5-ceramide等荧光神经酰胺类似物进行标记。上述神经酰胺是鞘脂，在高尔基体中高度富集。
在基于脂质的染料的帮助下，可以对脂筏等特定膜区域进行染色。使用NBD-6Cholestrol或NBP-12Cholestrol可以观察胆固醇富集区(AvhaitiPolarlipids)。
除了使用特异性非蛋白荧光染料来标记细胞区域外，还可以使用对细胞中不同位置有偏好的蛋白质来染色目标区域。这些蛋白质可以与荧光染料连接，并可以通过荧光显微镜观察到。使用这种方法的一个例子是麦胚凝集素(WGA)可以与细胞质膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特异性结合，将WGA与荧光染料连接起来，这样我们就可以观察到细胞质膜。
图4：Pukinje细胞，小鼠小脑皮质三重标记的纵侧截面图。红色：Anti-calbindin-D28k/Cy3;绿色：Anti-GFAP/Cy5;蓝色：Hoechst3258。
图5:牛肺内皮细胞。红色:用MitotrackerRedCMXRos标记的线粒体;绿色:用绿色荧光BODIPYFLPhallacidin标记的纤维状肌动蛋白;蓝色:用DAPI标记的细胞核。使用三维盲反褶积可以提高图像质量。
离子成像
在对神经元的研究中，观察基因活性或细胞运动对了解细胞的离子浓度具有重要意义。钠、钙、氯或镁离子对许多不同的细胞活性有很大的影响。一般来说，用荧光标记的螯合剂可以困住离子，螯合剂结合相应的离子后会改变离子的光谱特性。例如，利用这一原理的钙指示剂fura-2.indo-1.fluo-3.fluo-4和calcium-gren。
对于钠离子的检测，通常使用SBFI(sodium-bindingbofurzhaiisophthalate)或Sodiumgren。
有趣的是，还有基于蛋白质的钙指示剂，其中一种是基于水母化学发光蛋白的水母素。水母素。发光体腔肠素。分子氧和Ca2+的相互作用会释放蓝光，这是荧光蛋白发现过程中非常有名的机制。