细胞免疫荧光实验的方法、步骤有哪些？

细胞免疫荧光主要应用于细胞内抗原抗体检测，适用于细胞水平实验。那么细胞免疫荧光有哪些方法和步骤呢？让我们一起来看看吧！

一、直接法

将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

二、间接法（较为常用）

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。

三、操作步骤

1.倒出培养液。

2.润洗，将1ml SDwan全培养基沿培养板缓慢打入，盖上盖子，轻柔摇晃，先使用1ml的枪沿侧壁吸出润洗后，再使用200ul的枪沿壁吸出残液。

3.吹打，加入2ml SDwan全培养基，打在培养板底部，然后反复抽打，直至培养板底部由磨玻璃样变为透明。（吹打之后放置，后使用之前都要反复吹打）

4.将细胞爬片放入24孔板，每孔一个（注意每个孔只放一个，不要多放，注意检查）。

5.往（3）中吹打后的细胞液中继续加4ml的SDwan全培养基（即总计6ml）。将细胞液分装到24孔板中（分装之前吹打，防止细胞沉降而造成的不均匀），每个板500ul。注意事项：每一步打开细胞培养时，防止细胞培养板盖时勿使细胞培养板盖朝上放置。

6.在将细胞培养板放于培养箱之前，请喷酒精。

7.细胞培养24小时之内使用，最好20小时。沿侧壁吸出培养液。1PBS润洗2次，沿侧壁打入1ml或500ul PBS，轻柔摇匀2-3次后，沿侧壁吸出。

8.Pfu number/细胞数=pfuV/细胞数=感染复数 感染复数为2，加病毒20ul + 480ul SD培养液 感染复数为15，加病毒150ul + 480ul SD培养液 病毒滴数经提前测定为1*10-7pfu/ml

9.先加SD培养基再加病毒。（24h或48h之后进行（10））

10固定细胞：吸出上清，加4%PFA（组织固定液），1ml/孔，室温下30min。

11.PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。

12.细胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T为Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室温1h。

13.封闭：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween)  BSA 为牛血清白蛋白。1ml/孔，室温下2h。

14.一抗：用封闭液按1：100（比例依照抗体说明书）稀释，300ul/孔，4摄氏度过夜。

15.PBST（Tween）洗3次，10min/次 。

16.二抗（4℃抗体荧光抗体）：用PBST（Tween）按1：1000稀释，300ul/孔，室温避光1h。

17.PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室温避光10分钟。

18.PBS 洗2次，1ml/孔，立马抽出。

19.载玻片上滴加封片液，细胞爬片的细胞层与封片液接触。

20.荧光共聚焦显微镜观察。

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