稳定转染细胞系的建立

本文主要介绍稳定转染的原理、步骤，稳定转染能够得到稳定高表达的细胞株，是满足活性蛋白大量制备的方法。

利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳定转染。使用哺乳动物细胞表达蛋白，细胞的选择培养也不可忽视。常用的有中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和人胚肾细胞（HEK293）。德泰生物主要培养HEK293用于哺乳动物细胞瞬时转染，CHO细胞用于稳定转染。稳定转染通过稳定细胞系构建筛选出能够稳定表达的细胞株。针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量少，1mg质粒得到1mg蛋白，能够满足小量蛋白制备，大量生产成本很高。稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定表达，同时经过抗生素加压筛选，终得到能够稳定表达蛋白的细胞株。

稳定转染过程

1.细胞复苏

细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快复，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下：

1）预先加热水浴锅，温度37-40℃，并在离心管中准备好10ml培养基

2）从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀

3）当冻存管内*融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有10ml培养基的离心管中

4）离心5min，去除上清，得到沉淀

5）用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规培养

细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。

2.瞬时转染

以Lipofectamine转染试剂为例的操作流程，不同转染试剂参考说明书

1）将复苏后常规培养的细胞按照1-3×10^5接种到6孔板中，加入2-4ml的*培养基，混匀放置在二氧化碳培养箱中37℃过夜

2）无菌状态下配置如下溶液：a 用100ul的无血清培养基稀释2ug的待转染的质粒

b 用100ul的无血清培养基稀释25ul的Lipofectamine转染试剂（血清的存在会影响转染效率，因此要使用无血清培养基转染）

3）将ab溶液混合并摇匀，室温下放置30min左右

4）细胞培养80%单层左右，用无血清培养基洗涤细胞2次，每孔加入1ml的无血清培养基，并将混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向轻摇混匀，二氧化碳培养箱中37℃培养24小时

5）将转染液倒出，换为*培养基继续培养

3.稳定细胞系筛选

24-72h加入选择性抗生素筛选稳定细胞株，预实验确定抗生素的浓度，确定抗生素对所选细胞的低作用浓度。

1）提前一天接种细胞与24孔板中，待第二天长成25%单层为宜，二氧化碳培养箱中37℃过夜培养。

2）第二天将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）。

3）培养15天左右绝大多数细胞死亡抗生素浓度为准，一般为400-800ug/ml，筛选细胞时刻适当提高浓度

4）二氧化碳培养箱中37℃培养72h后按照1:10的比例将转染细胞传代，使用预实验得到的抗生素浓度的培养基培养。后挑选单克隆，有限稀释法挑取单克隆。

 有限稀释法：将细胞消化下来做连续的10倍稀释，每稀释一梯度都在9孔板中培养，生长一周左右再次挑取单克隆进行培养，如此反复3次。

5）Western blot或ELISA检测蛋白的表达情况，挑取多个单克隆进行表达检测，筛选出表达量的克隆传代并保存。

终筛选出稳定高表达目的基因的细胞株，相对于瞬时转染稳定细胞系构建节约大量的时间和成本，是满足活性蛋白大量制备的方法。