基于稳定同位素标记和随时间变化代谢轮廓分析的外源性代谢物检测和鉴定分析方法

建立高准确度和普适性的外源性代谢物检测和鉴定分析方法对于评价药物等化合物的安全性至关重要。基于液相色谱–四极杆串联高分辨质谱技术（LC/HRMS/MS），先应用稳定同位素标记目标原型化合物（13C和2H），再进行特征峰识别和配对同位素峰过滤鉴定代谢物，通过代谢物随时间变化的轮廓分析确证代谢物，建立了高准确度的外源性代谢物检测和鉴定分析方法。

该研究使用未标记、13C标记和2H标记的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）处理拟南芥属T87细胞，经液相色谱高分辨质谱分析后进行特征峰识别和配对同位素峰过滤，得到83个候选代谢物，确认了26个2,4-D的代谢物，其中包括10个已报道代谢物和16个新发现的代谢物。

具体研究策略见图1。

图1 T87细胞中2,4-D代谢物研究策略

该研究共包括三个数据集：1、未加药组和2,4-D给药组；2、2,4-D给药组和13C8-2,4-D给药组；3、2,4-D给药组和2H5-2,4-D给药组，每组细胞样品均在加药0、1、3、7和10天时间点取样分析。经质谱分析后数据集1得到30853个特征峰，扣除未加药组内源性特征峰并进行35Cl/37Cl同位素表型分析后，得到潜在代谢物645个，但这其中仍可能包含大量假阳性结果；数据集2得到34559个特征峰，对2,4-D给药组和13C8-2,4-D给药组在0、1、3、7和10天时间点的特征峰峰面积轮廓进行统计分析（火山图分析，log2-fold chhaige>|1|和p<0.05）排除内源性代谢物，得到差异特征峰1626个，再进行同位素特征峰配对过滤（Δm/z 8.0272 Da，质量偏差＜5ppm），得到候选代谢物81个；数据集3分析处理流程与数据集2相同，得到候选代谢物76个。综合数据集2和数据集3数据，总共得到候选代谢物83个，三个数据集分析流程见图2。

图2 数据集分析流程（a, 数据集1；b, 数据集2；c, 数据集3）

对83个候选代谢物进行了鉴定，通过Metabolizer软件预测了2,4-D可能的所有代谢反应和代谢产物，包括Ⅰ相代谢（氧化/脱烷基化/羟基化）和Ⅱ相代谢（葡萄糖醛酸结合/氨基酸结合/谷胱甘肽结合/硫酸结合）反应，得到7029个推测代谢物。将83个候选代谢物高分辨质谱数据与推测代谢物进行比对（质量偏差＜5ppm），鉴定得到了26个代谢物，其中包括10个已报道代谢物和16个新发现的代谢物。作者等人通过二级质谱特征离子先终确证了16个新发现代谢物的结构。图3为推测的2,4-D在T87细胞内的代谢途径和代谢物随时间变化的代谢轮廓。

图3 推测的2,4-D代谢途径（a）和部分代谢物随时间变化的代谢轮廓（b）

根据代谢反应的不同将鉴定的代谢物分为6组（A-F）。根据每组外源性代谢物随时间变化代谢轮廓的不同进一步对鉴定的26个代谢物进行了确证（见图4）。

图4 各组代谢物（A-F）随时间变化的代谢轮廓分析

该研究建立的基于稳定同位素标记和代谢物随时间变化的代谢轮廓分析方法有助于外源性代谢物在生物体内的准确检测和鉴定，可有效减少假阳性率，为全面的外源性代谢物的高通量鉴定提供了参考。

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